基于3D肝细胞球模型的计算机化预测方法在基因毒性和致突变性评估中的应用与验证

为解决传统体外基因毒性测试特异性低、动物实验伦理争议等问题，法国雷恩大学等机构研究人员开发了3D人类肝细胞球（Hepoid）模型，通过γH2AX检测、彗星实验、微核试验和转录组分析等方法，系统评估了甲基甲烷磺酸酯（MMS）、黄曲霉毒素B1（AFB1）等典型基因毒性致癌物及杂环芳香胺（HAAs）的DNA损伤效应。该研究首次在生理相关浓度下证实HAAs可诱导人类肝细胞DNA损伤，为环境污染物风险评估提供了创新性体外平台，显著推进了"3R原则"在毒理学研究中的实践。

　　

在毒理学和药物安全评估领域，传统体外基因毒性测试长期面临特异性不足的困境，哺乳动物细胞实验频繁出现的假阳性或假阴性结果，迫使研究者仍需依赖动物实验进行验证，这不仅与"3R原则"（替代、减少、优化）相悖，也因物种间代谢差异可能导致风险评估偏差。尤其对于肝脏这一承担外源物解毒和活化双重功能的关键器官，现有二维（2D）培养模型难以模拟体内复杂的微环境，使得致癌物特别是需要代谢激活的前致癌物（如杂环芳香胺）的基因毒性评估存在显著局限性。

针对这一系列挑战，法国雷恩第一大学（Université de Rennes 1）和法国国家健康与医学研究院（Inserm）的研究团队创新性地建立了3D人类肝细胞球（Hepoid）模型系统。这项发表在《Toxicology》的研究，通过整合自动化图像分析算法与多组学技术，首次在接近生理条件的体外模型中实现了对基因毒性和致突变性的精准预测，特别揭示了食品污染物杂环芳香胺对人类肝细胞的DNA损伤风险。

研究采用两种人类肝细胞来源：永生化HepaRG细胞系和原代人类肝细胞（PHH），通过胶原基质三维培养形成具有极性和空心结构的肝细胞球。关键技术包括：（1）基于深度学习的γH2AX焦点自动定量系统；（2）改进型彗星实验分析DNA链断裂；（3）机器学习辅助的微核识别算法；（4）UPLC-ESI/MS³检测DNA加合物；（5）RNA-seq转录组分析毒性标志物TGx-DDI。原代肝细胞来自6例不同临床背景的供体，用于评估个体差异。

5.1 DNA链断裂检测
通过γH2AX免疫染色发现，直接作用型基因毒物MMS在125-450 μM范围内呈剂量依赖性增加DNA双链断裂（最高8.4倍），而需代谢激活的AFB₁（6 μM）诱导1.8倍升高。彗星实验显示，AFB₁和1,2-二甲基肼（DMH）在PHH中造成的DNA迁移程度显著高于HepaRG模型，其中PHH-2样本对DMH（10 mM）的敏感性达HepaRG的3.9倍，证实原代细胞具有更强的代谢活化能力。

5.2 染色体畸变分析
微核试验自动化系统成功识别出纺锤体毒物秋水仙碱和长春碱诱导的染色体丢失（4.6和4.3倍增加），而AFB₁仅在高浓度（2 μM）引起微核率升高。值得注意的是，非基因毒性肝致癌物邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）在所有测试中均为阴性，验证了模型区分不同作用机制化合物的能力。

5.4 杂环芳香胺评估
针对4种IARC 2A/2B类致癌物（AαC、IQ、MeIQx、PhIP）的研究发现，AαC和IQ在20 μM即可通过彗星实验检测到显著DNA损伤（PHH-2样本达3.8倍），且AαC形成的dG-C8加合物水平在3D模型中比2D培养高4.3倍。转录组分析揭示CYP1A2等代谢酶基因显著上调，解释了其强基因毒性机制。

这项研究的意义在于：首先，建立的Hepoid模型突破了传统2D培养在代谢功能维持和时间跨度上的限制，空心球状结构确保营养物质渗透和长期（4周）实验可行性；其次，开发的自动化分析流程将γH2AX和微核检测效率提升10倍以上，减少人为偏差；最重要的是，首次在接近人类实际暴露浓度（μM级）下证实了HAAs的基因毒性风险，为食品污染物风险评估提供了新依据。研究者特别指出，PHH模型表现出的个体差异（如PHH-2对DMH高度敏感）提示该平台可用于个性化毒性预测。未来通过整合微流控技术和非实质细胞共培养，将进一步增强模型在药物开发和环境毒理学中的应用价值。