From in vitro to in vivo 蛋白功能研究的强大平台 |
LICOR Odyssey双色红外激光成像系统 |
|
红外激光成像原理
传统的荧光染料由于激发和检测波长位于可见光谱区域，易形成介质（NC膜、PVDF膜、尼龙膜、孔板、培养皿、组织等）的自身荧光，即导致高背景信号，因而不能有效地用于检测膜、孔板、培养皿、或者组织上的蛋白。由于在红外光谱区域（670-1100nm），这些介质基本无自身荧光，因此红外波长检测蛋白具有低背景、高灵敏度、高信噪比的优点。
|
|
| 美国LI-COR公司的Odyssey双色红外激光成像系统基于这个原理及其专利的红外染料技术，能够通过两通道的红外激光对蛋白进行高效的检测：红外激光器产生两种波长的激光（680nm和780nm），分别激发红外荧光染料产生720nm和820nm的发射光，再由两个高灵敏度的雪崩式光电二极管同时检测信号强度。由于Odyssey采用的是激光激发荧光染料，其发光机理完全不同于传统的底物显色或化学发光的酶促反应，因此可用于蛋白的精确定量检测。 |
|
双色红外激光成像简介
定量精确
直接的荧光检测是Odyssey具有卓越的定量精确性的关键。检测过程中，激光激发红外标记抗体发出荧光，荧光信号强度和蛋白风度具有极好的线性相关性。而基于酶促反应得化学发光法在一定时间内只有部分底物发生反应，其定量的精确性十分依赖于起始时间和曝光时间，其检测易受到诸多因素的影响而导致定量不准确。
|
 |
蛋白点杂交分析比较化学发光和红外荧光检测技术的定量线形和范围
稀释小鼠抗体作为抗原，分别用HRP偶联或红外染料标记的羊抗鼠二抗检测。化学发光采用ECL底物和CCD检测不同曝光时间的结果；而红外荧光结果在Odyssey一次扫描完成。结果线性准确度上化学发光因曝光时间不同而差异很大，而Odyssey线性关系相对比较好；线性范围上化学发光是250倍，而Odyssey达到了4000倍。 |
|
直接检测
杂交以后直接扫描成像，无需胶片、暗房或复杂的染色及显色过程，大大节约实验时间和试剂成本，实验效率得到大幅度的提高。
|
|
双色成像
可用两种不同波长的红外染料对不同的生物分子（蛋白或核酸）标记和同时检测，杂交检测条件均等，数据对比性强，结果直观。两种染料的最大发射波长相差100nm，杜绝无光谱重叠，因此可用于进行两种信号间精确的量化分析。 |
Tubulin和IkappaB同时双色检测
700通道信号显示为红色，IkappaB；800通道信号显示为绿色，Tublin。两个靶蛋白在一张膜上同时扫描成像 |
清晰的成像结果
Odyssey红外检测方法有效消除了膜、孔板等介质的自身背景荧光，可以得到清晰、锐利的条带。一次杂交中强带和弱带都可清晰成像，可以避免化学发光产生的强信号条带曝光过度或严重的扩散现象（smear）及多重曝光的定量不确定性。
|
|
高灵敏度
针对Western blot，Odyssey是唯一灵敏度可达到皮克级（pg）的荧光系统，其检测效果优于化学发光法。
功能强大的软件系统
Odyssey软件提供多种界面友好、功能完善的分析工具，可快速判定样品分子量大小并惊醒定量分析。
双色红外激光成像系统在蛋白、分子成像研究中的应用
双色Western Blot——蛋白磷酸化修饰研究
Odyssey红外激光成像系统是蛋白Western Blot检测的最佳选择，不仅因为Odyssey系统具有相当高的灵敏度和最佳的定量精确性，还因为该系统具有双通道检测功能，这对于蛋白翻译后的修饰过程研究非常有效。 |
ERK1和ERK2的酪氨酸磷酸化
观察EGF刺激后A431细胞中ERK1 and ERK2 (p44/42 MAP kinases)的磷酸化情况, 一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠抗磷酸化ERK抗体,二抗用 抗兔的IRDye800 标记的抗体 (green),和抗鼠的 Alexa680 标记的抗体 (red) |
|
蛋白的研究不仅需要量化，修饰化研究更是一项重要内容。Odyssey系统的双色功能极大方便了针对蛋白的不同修饰、剪切变化的研究。同时使用两种红外染料，标记两种抗体同时分析中个靶分子，这项技术是化学发光和同位素方法难以实现的。
在一张印记杂交膜上的双色Western Blot蛋白分析，会得到更快更准确地蛋白磷酸化（或其它修饰化）的检测结果（如图），排除了由于分别两次实验造成的分析结果误差。高清晰的成像也使得发现由于蛋白修饰而引起的迁移率漂移变得更加容易。
微孔板In-Cell Western分析
利用Odyssey红外成像系统进行的ICW是高通量信号传导通路分析和药物筛选的最佳选择。Odyssey可以直接对96或384孔板内的细胞内蛋白进行精确的定量检测。ICW使用红外标记的二抗直接标记细胞内蛋白，量化微孔板每个孔内的荧光信号。不仅节约时间，提高检测效率，还避免了传统WB易出错的操作步骤，例如裂解细胞、凝胶电泳和转膜等。
Odyssey ICW软件可用来扫描微孔板、样品定位、精确定量以及数据分析。每个检测通道的荧光图像可独立显示，并采用不同颜色（红色和绿色）。当两个图像相互重叠时，通过颜色的变化可计算蛋白的修饰化程度。 |
活细胞内检测EGF对ERK磷酸化的刺激效应以及P168393对其抑制的作用 |
Odyssey小动物活体分子成像系统
基于红外技术，LI-COR在Odyssey平台上推出专业的小动物活体分子系统部件MousePOD及其分析软件。根据红外波长区域内生物体内的水分子和过氧化物对光信号吸收值最低的原理，红外激光检测活体荧光信号时，生物体自身背景荧光低、目标信号灵敏度高，信号穿透力强。
通过将结合有IRDye800CW红外染料的探针注入小动物体内，探针特异性的结合到活体内的目标区域，激光激发发后，扫描检测荧光信号并计算其强度，从而研究蛋白在活体内的定位和功能。
红外活体检测技术具有穿透力强、背景低、灵敏度高的特点，是未来生物活体检测的主流方向
|
|
|
|
