2、结果
Mabselect
试验结果显示当洗脱pH 在3.5 以上时对回收率有显著的影响，并且随着洗脱pH的提高，洗脱峰的宽度也随之增加。洗脱pH 在3.0-3.5 之间，产品能有较好的回收率。然而，如果只收集三个柱体积的洗脱液时，在pH 3.5 以上洗脱会由于峰的拖尾而影响峰的回收率。如此而言，如果想在pH 4.0 进行洗脱而且想要得到理想的回收率，就必须延长洗脱体积。上样量、洗脱流速以及洗脱pH对终产品中宿主细胞蛋白、小分子杂质都有统计上的显著性影响，优化层析条件能较好地使这两种杂质降低到极低的水平。尽管这些影响因素具有统计学上的显著性影响，然而在实际应用中影响是比较小的，尤其当考虑检测误差时。进一步，这些杂质能在下几步的层析当中有效地除去。

Prosep-rA
对Prosep-rA 的实验则表明，影响其回收率的重要因素则更多。然而，相对于Mabselect 而言，Prosep-rA 的回收率具有更高的稳定性。而且，在所有的实验过程中，Prosep-rA 的回收率都保持在90%以上。因此，对Prosep-rA而言，没有确定出对其回收率具有显著性影响的因子。当然，洗脱缓冲液中的NaCl 的浓度、洗脱的pH 对洗脱液中宿主细胞蛋白含量却有非常显著的影响。当使用严格的洗脱盐浓度和教高的洗脱pH 时，能有效降低洗脱液中宿主细胞蛋白的含量。洗脱pH、盐浓度以及上样pH都对洗脱液中小分子杂质具有重要影响，当使用更严格的洗脱盐浓度、低pH时，能降低小分子杂质的含量，同时，降低上样样品的pH也能降低产品中小分子杂质的含量。

3、讨论
通过对Prosep-rA 和Mabselect 的实验模型设计、实验条件的优化以及实验结果的比较，这两种凝胶的回收率比较接近(95% 的置信区间)。然而，在Prosep-rA 的洗脱液中的宿主蛋白含量几乎为Mabselect中的7 倍，而且，Prosep-rA洗脱液中的小分子杂质的含量也明显比Mabselect 高得多。

4、结论
通过对凝胶的寿命、载量、压力与流速的关系等的研究，DOE(Design of Experiment)可以建立一个基准系统以便从多种凝胶中选择出合适的凝胶用于生产。另外，DOE还可用于考察不同的影响变量以及用于实验条件的优化。在本研究中，IDEC公司发现，Prosep-rA 和Mabselect 分别受不同的过程变量的影响。当洗脱pH 大于3.5 时能显著影响Mabselect 纯化产品的回收率，而pH 对Prosep-rA 纯化产品的回收率却不受洗脱条件的影响。各种上样、洗杂蛋白、及洗柱条件都不影响

Mabselect 纯化产品的纯度，在层析中其去除杂质的能力比Prosep-rA 高达4600 倍。

三、通过优化Mabselect 每批生产20 公斤抗体^[3]
（本试验由Protein Design Labs (PDL), Inc., CA, USA 在2002 年Gab2002 会议上提供）
在人源化抗体纯化的蛋白设计实验室(PDL)，ProteinA大多是在细胞去除后用于捕获的第一步层析。亲和填料rProteinA Sepharose Fast Flow已经在过去的临床生产中成功地应用了六年，然而在将来的商业化生产中要达到20 kg每批的产量，需要一种更坚固的层析凝胶以装填直径达1 米甚至更大的层析柱。

PDL 研究了四种不同刚性的凝胶的结合容量和动态载量，这四种凝胶分别是：HyperD proteinA，Poros 50A，BioProcess ProteinA 以及Mabselect。Mabselect 在流速150-500cm/h 之间具有最高的结合载量和可接受的柱反压。当流速分别在150，300 和500 cm/hr，在10%的流穿条件下，Mabselect 的动态载量分别是39 g/l，35 g/l 和30 g/l；在装柱高度为20 cm 高时，产生的反压分别是：1.52 bar (22 psi，0.15 Mpa)，1.66 bar (24 psi，0.17 Mpa)，1.93 bar (28 psi,0.19 Mpa)。基于这些实验结果，PDL 选择了Mabselect 进行工艺优化。优化是按照典型的临床生产工艺设计的。它包括柱平衡、上样、洗杂蛋白、洗脱、再生、除菌和保存。平衡的优化是为了找出最少的缓冲液用量使柱子从乙醇保存状态达到pH的平衡。上样优化是为了提高回收率，降低凝胶用量并在合理的时间内完成上样。如果在一个层析循环内完成20 kg样品的纯化，用185 L 胶在150 cm/hr 的上样速度能比500 cm/hr 的上样流速提高4%的回收率(800 g 抗体) ；如果每批分成四次上样，则能减少46 L 凝胶，但上样时间会延长5 小时。上样之后，用平衡缓冲液洗柱以洗去杂质，如宿主DNA、宿主细胞蛋白等。我们发现，在用四次上样纯化20 kg 抗体时，洗柱流速在150cm/hr 时洗去宿主细胞DNA 和蛋白的效果要比500
cm/hr 更好，而且能节约5000 L 的缓冲液用量，但每个循环的洗柱时间会延长16 分钟。

低pH 缓冲液被用于洗脱。我们用pH 6-3，10 个柱体积的梯度来优化选择洗脱pH。用500 cm/hr 的洗脱流速以希望尽快完成洗脱，慢流速洗脱将导致蛋白沉淀在层析柱上，并需要再生以去掉这些沉淀蛋白。

在PDL的临床生产中，使用了6 M盐酸胍做在位清洗。然而，盐酸胍傲贵而且易于腐蚀柱子的不锈钢配件。事实上，在每周的生产中演算胍的费用达到了60000 美元。为了降低清洗费用和减少柱子的腐蚀，我们测试了8 M 尿素和1 M 醋酸进行在位清洗。但这些试剂没有成功。然而，0.1 M 的NaOH却能非常有效地清洗掉柱上沉淀的蛋白和其它杂质，因此，NaOH 被用作新的清洗剂。