普洛麦格中文通讯 2002年第五期

图3. Promega 公司 Taq DNA Polymerase in Storage Buffer B, Taq DNA Polymerase in Storage Buffer A and GoTaq^TM DNA Polymerase 扩增反应结果的比较。使用Promega 公司的Taq DNA Polymerase in Storage Buffer B (第1，5，9，13，17泳道) 结合Thermophilic DNA 聚合酶缓冲液（产品目录号：M1901），Taq DNA Polymerase in Storage Buffer A (第2，6，10，14，18泳道) 结合Thermophilic DNA 聚合酶缓冲液，GoTaq^TM DNA Polymerase (第3，7，11，15，19泳道)结合无色GoTaq^TM反应缓冲液，GoTaq^TM DNA Polymerase (第4，8，12，16，20泳道)结合绿色GoTaq^TM反应缓冲液分别对 3.3ng 人基因组DNA中的360bp的α-1胰岛素抗性基因片段（产品目录号：G3041），1ng 鼠基因组DNA中的1.1kb IL-1? 片段（产品目录号：G3091），3.3ng 人基因组DNA中的1.8kb APC片段，33ng 人基因组DNA中的2.4kb APC片段，75ng 人基因组DNA中的3.1kb APC片段进行扩增反应。M泳道为BenchTop 1kb DNA Ladder (产品目录号：G7541)。所有扩增反应中使用的dNTP均为Promega的PCR Nucleotide Mix (产品目录号：C1141)。

A3800）产生cDNA模板而后用GoTaq^TM DNA聚合酶和绿色或无色GoTaq^TM反应缓冲液PCR扩增275bpβ-actin基因。GoTaq^TM DNA聚合酶能够扩增出靶基因，并且两种GoTaq^TM 缓冲液的产率和灵敏度是相同的（图4）。图4显示了采用20μl ImProm－ⅡTM cDNA反应物作为模板进行PCR扩增。也可依照ImProm－ⅡTM 逆转录系统技术手册

图4. 从总RNA检测β-actin 片段. 用Promega 公司的SV Total RNA Isolation System（产品目录号：Z3500）从Jurkat细胞中提取总RNA，用Promega公司的ImProm-II 反转录系统（1），在20μl反应体系中用图中所显示量的总RNA反转录生成cDNA。全部的20μl cDNA 被用于100μl 体系的PCR反应中，PCR反应使用GoTaq^TM DNA 聚合酶结合无色或绿色GoTaq^TM反应缓冲液，以Oligo(dT)作为引物扩增长度为275bp的?-actin 片段，M泳道为100bp DNA Ladder (产品目录号：G2101)。所有扩增反应中使用的dNTP均为Promega的PCR Nucleotide Mix (产品目录号：C1141)。

TM263中的介绍，采用1μl cDNA反应物作为模板进行PCR扩增（数据没有显示）。我们已证明 GoTaq^TM DNA聚合酶及其任一种GoTaq^TM反应缓冲液能够用于反转录系统（产品目录号：A3500）产生的cDNA的PCR扩增反应。（表1，特异数据没有显示）。对于任一种非偶联RT-PCR，进行PCR扩增反应需要考虑MgCl₂、dNTPs和缓冲液的浓度。值得注意的是，当计算扩增反应中加入的MgCl₂的总量时，要记住和许多缓冲液不同，GoTaq^TM反应缓冲液中已包含有终浓度为1.5 mM 的MgCl₂。

T-载体克隆
　　用GoTaq^TM DNA聚合酶扩增的产物带有A突出端，适合于T-载体克隆。为显示这一点，我们采用GoTaq^TM DNA聚合酶及其绿色或无色GoTaq^TM反应缓冲液扩增542bp片段，采用Wizard(r) MagneSilTM PCR纯化系统（Cat# A1930），纯化扩增产物并克隆到pGEM(r)-T Easy载体系统（产品目录号：A1380），操作步骤参照技术文献（2, 3）。我们发现采用绿色GoTaq^TM反应缓冲液重组克隆百分率为82%(白色克隆菌数/总克隆菌数×100)，采用无色GoTaq^TM反应缓冲液,重组克隆百分率为83％。pGEM(r)-T Easy系统提供的插入对照产生89％重组克隆。（无插入对照重组克隆百分率<1%），这表明采用GoTaq^TM DNA聚合酶及GoTaq^TM反应缓冲液扩增的插入子有A-突出末端，可以克隆到T-载体中。另外，采用GoTaq^TM DNA聚合酶及其GoTaq^TM反应缓冲液扩增的DNA片段也可克隆到pTARGETTM哺乳动物表达载体系统中（产品目录号：A1410）（数据没有显示）。