普洛麦格中文通讯 2002年第五期

摘要：

　　Gold T_NT^® T7 Express 96系统是Promega公司体外表达产品系列的最新产品。该系统的组成成分和原有的T_NT^® 偶联转录/翻译体系相似，只是对荧光酶的特异性更高，另外，Gold系统成分适合在96孔板上进行大规模筛选分析。本文作者采用Gold T_NT^® T7 Express 96系统进行体外表达克隆（IVEC），成功识别了分离酶的底物基因。

IVEC（体外表达克隆）是一种识别新基因有效技术，主要根据基因产物的生化特性识别基因。

　　Gold T_NT^® Express 96系统有SP6和T7两种类型，用来转录/翻译克隆在T7或SP6 RNA聚合酶启动子下游基因。使用这个系统，将含有适当启动子的质粒DNA、未标记或标记[35S]的甲硫氨酸以及无核酸酶水（目录号P1193）加入到含有裂解物的96孔板上。合成的蛋白质通过功能检测或经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及随后的荧光显像仪、颜色/化学发光法或放射自显影检测。

　　在经典生化方法中，根据蛋白特异活性纯化蛋白，通过得到的氨基酸序列信息分离相应的基因。然而当传统生化方法应用受到限制时，“反向”生物化学成为识别新基因及其表达蛋白的重要研究工具。IVEC主要根据基因产物的生化特性识别新基因，是一种功能强大的技术。这种功能基因组学研究不依赖相应蛋白的纯化技术。

　　IEVC的研究策略如下：将一个cDNA文库分成小的子库，每个子库含有50－100个克隆，而后每个子库进行体外表达产生小的蛋白质库，这些蛋白用于酶学分析、相互作用分析或蛋白活性分析。如果在一个蛋白库中发现有相应特性的蛋白存在，即可通过子库中基因系统分类容易地筛选到相应基因，这种技术称为姊妹选择（sib selection）(1-4)。

在96孔板上进行IVEC筛选

　　最近，体外表达cDNA文库和偶联转录/翻译系统都成功地应用到96孔板上。这种改进大大降低了进行IVEC筛选操作所需要的时间，从而成为一种高通量筛选方法，即使在小实验室也可进行。

　　我们将IVEC研究和Gold T_NT^® T7 Express 96系统结合起来，寻找分离酶的底物基因（图1）。分离酶是一种位点特异性半胱氨酸内肽酶，通过剪切多亚基蛋白复合物 -- 粘合素Scc1 -- 控制姊妹染色单体的分离。粘合素复合物介导姊妹染色体的粘联直到细胞分裂后期。在哺乳动物减数分裂细胞中，Scc1是唯一的分离酶底物。我们想通过IVEC方法识别这种特异靶蛋白基因。为达到此目的，我们首先制备了有活性人源分离酶，并将其活性位点的半胱氨酸置换为丝氨酸制备突变分离酶。用来作为阴性对照。野生型分离酶能够切割体外表达的Scc1蛋白，而无活性的分离酶突变体或单纯反应体系T_NT^® 裂解液不能进行切割。我们采用鼠脾脏cDNA文库和Gold T_NT^® T7 Express 96系统进行筛选。该文库包含5个96孔板，每个孔含有50－100个克隆，总共大约有36,000个克隆。