普洛麦格中文通讯 2002年第五期

　　取出5个 -70℃保存的Gold T_NT^® T7 Express 96孔板，板的每个孔中均含有已优化的20μl网织红细胞裂解液，将板放置在冰上溶化10分钟，。用多道移液器从文库的每个孔吸取0.6μg DNA加入到96孔板上，并且向每个反应孔中加入1μl [³⁵S]甲硫氨酸（1,000,Ci/mmol, 10 m Ci/ml），反应总体积为25μl。将Gold T_NT^® T7 Express 96系统平板放置在30℃温育90分钟，而后每孔取4μl转移到新的96孔板中，并且加入2μl野生型或突变型分离酶，37℃温育90分钟后，每孔加入20μl SDS载样缓冲液，70℃加热3分钟，将每个库野生型或突变型分离酶消化的样品相邻定量加入到10－15％SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后，在25％甲醇/7.5％乙酸溶液中固定后用水进行漂洗，以除去未整合的甲硫氨酸。最后干燥的聚丙烯酰胺凝胶用Kodak BioMax^® MR胶片曝光48小时。

结果：
　　对480个蛋白库进行分析，只有1个带型在野生型和突变型分离酶消化上表现出差异，在D6库中一80kDa蛋白经有活性分离酶作用后转变为75kDa (图2)。
　　我们观察到每个含有50－100个克隆的cDNA库翻译后平均产生25－30个[³⁵S]标记的蛋白带（图2）。这种差异以前也有报道（1，2）。蛋白带和克隆数目的差异表明有非编码序列存在和/或部分基因缺失有效的起始密码子。表达蛋白带浓度不同，反映出蛋白中甲硫氨酸的数目不同以及mRNA的翻译效率的差异。在我们实验室中采用这种方法比以往的IVEC筛选更经常观察到分子量大于150kDa的蛋白条带，表明文库中cDNA片断比较大。采用原来的TNT(r) 裂解液进行姊妹选择操作产生的信号弱于Gold T_NT^® T7 Express 96系统，其原因可能是和TNT^® 快速偶联/翻译系统相比，Gold T_NT^® T7 Express 96系统的荧光素酶活性有更高的特异性（7）。

结论：
　　Gold T_NT^® T7 Express 96系统将高质量的体外转录/翻译偶联系统应用到96孔板上。我们采用IVEC方法检测了该系统，结果表明其非常有效。裂解物中包含了氨基酸（甲硫氨酸除外）和T7 RNA聚合酶，只需加入[³⁵S]甲硫氨酸和DNA。只有两步加样步骤，操作简单方便，起始翻译所需要的操作大大减少。如果96孔板模式及多道加样器，操作时间仅需1个小时，即可产生代表整个表达文库的480个[³⁵S]标记的蛋白质库。我们认为，在用IVEC进行大规模文库筛选时，Gold T_NT^® T7 Express 96系统极为有效。该系统提高了实验速度而且可以方便地用于高通量分析。

　　图2. 体外翻译蛋白质库的筛选，用野生型分离酶或分离酶突变体消化后进行SDS-PAGE电泳并用放射自显影检测。顶部数据是蛋白质库的序号；图右面数据是蛋白分子量标准，单位是kDa。红星表示能被野生型分离酶切割，不能被分离酶突变体切割的mScc1。W.t.＝野生型分离酶，C→ S＝分离酶突变体。

参考文献：
1． Lustig, K.D. et al. (1997) Meth. Enzymol. 283, 83-99.
2． King, R.W. et al. (1997) Science 277, 973-974.
3． Masu, Y. et al. (1987) Nature 329, 836-838.
4． Wong, G.G. et al. (1985) Science 228, 810-815.
5． Nasymth, K., Peters, J.M. and Ulhmann, F. (2000) Science 288, 1379-1385.
6． Stemmann, O. et al. (2001) Cell, 107, 715-726.
7． Promega Product Information #9PIL560, Promega Corporation.

操作手册：
　　Promega公司Gold T_NT^® T7 Express 96 System和Gold T_NT^® SP6 Express 96 System技术手册TM054
　　（www.promega.com/tbs/tm054/tm054.html）

订购信息

产品	包装	目录号
Gold T_NT^® T7 Express 96 System	96孔	L5600
Gold T_NT^® SP6 Express 96 System	96孔	L5800
	5×96孔	L6501
ProteoLink^TM In Vitro Expression Cloning System （Human Adult Brain）	10×96孔	L6502