简介
临床试验表明，对程序性细胞死亡受体1（PD-1）和程序性细胞死亡配体1（PD-L1）通路的治疗阻断可产生持久的抗肿瘤反应，并改变了包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种晚期癌症的治疗(1)然而，只有少数（不到20%）的非小细胞肺癌患者能够从抗PD-1/PD-L1免疫治疗中获益，而这些患者中有20-40%发生了严重的不良反应(2)确定哪些患者更有可能从免疫检查点阻断（ICB）中获益，最大限度地提高疗效，减少毒性，这一点具有重要意义。
目前，PD-L1表达是食品和药物管理局批准的NSCLC预测性生物标志物(1)我们之前的研究表明，虽然PD-L1强阳性NSCLC患者的生存率最大，但ICB治疗也显著提高PD-L1阴性NSCLC的生存率(2)结果表明PD-L1的表达是一个不完善的生物标志物。此外，一些特定癌基因和肿瘤抑制基因（TSG）的体细胞突变，包括表皮生长因子受体,克拉斯，和P53基因，已被证明与ICB治疗的疗效相关。肿瘤细胞的免疫机制，如肿瘤细胞的多种基因表达，如肿瘤细胞的基因重组(三–5).
为了识别先前未被确认的免疫调节剂，我们在一只老鼠身上进行了CRISPR筛选喀斯特G12D型/Trp53?/?（KP）肺癌模型（C57BL/6背景）(6)发现结节性硬化综合征亚单位1(Tsc1)和亚单位2(Tsc2)作为Pd-l1表达的有效调节因子和对Pd-1阻断治疗的敏感性。TSC1/TSC2介导磷脂酰肌醇3激酶-AKT和肝激酶B1-腺苷5′-单磷酸激活蛋白激酶通路之间的串扰，通过小鸟苷三磷酸酶Rheb抑制雷帕霉素复合物1（mTORC1）信号转导的哺乳动物靶点，并发挥抑癌作用(7).失活突变TSC1/TSC2导致结节性硬化，一种常染色体显性遗传疾病，也经常发生在许多人类癌症中，包括非小细胞肺癌(8)在这里，我们使用肺癌细胞系、患者样本、癌症基因组图谱（TCGA）数据库和同基因小鼠模型来全面研究两者之间的临床相关性TSC1/TSC2非小细胞肺癌的现状、免疫特性及ICB治疗的疗效TSC1/TSC2-非小细胞肺癌。
结果
体外和体内筛选鉴定Tsc1/Tsc2作为NSCLC免疫调节剂的候选
为了系统地评价细胞内在的抗肿瘤免疫调节因子，我们利用小鼠KP肺癌模型进行了体外和体内CRISPR筛选(图1A).如前所述，KP细胞被工程化以表达Cas9，并且选择了两个克隆的KP-Cas9细胞系（克隆7和9），以便为后续筛选提供遗传和细胞同质性(6)将KP-Cas9克隆转染单导RNA文库并传代后，流式细胞术观察到PD-L1的表达发生明显的变化，并将前15%PD-L1-高种群和前15%PD-L1-低种群进行了分类(图1、B和C).通过下一代测序，我们发现Tsc1和Tsc2在PD-L1低水平人群和PD-L1高水平人群中sgRNAs显著减少的热门研究之一(P<0.05；图1、B和C)，表明Tsc1或Tsc2潜在促进PD-L1表达。
图1体外和体内CRISPR筛选确定Tsc1/Tsc2为免疫调节剂的候选。
(A)CRISPR筛选系统图。抗体。(B和C)KP-Cas9克隆7（B）和KP-Cas9克隆9（C）的体外筛选。对前15%Pd-l1-高和前15%Pd-l1-低人群进行分类，并对Tsc2和Tsc1富含Pd-l1-高浓度人群。蓝峰，空载体转染细胞；红峰，sgRNA文库转染细胞池。(D)相对读取数Tsc2和Tsc1KP-Cas9克隆7的体内筛选。每组筛选6只小鼠12个肿瘤*P<0.05和**P<0.01。APC，别藻蓝蛋白。
为了进行体内筛选，从第7天开始用PD-1抗体或同型对照（ctrl）对携带KP-Cas9克隆7的免疫活性C57BL/6小鼠进行治疗（每周3次）。2周后，每组6只小鼠取12个肿瘤进行扩增子测序。与同型对照组相比，sgRNAs的Tsc2在PD-1抗体组中明显减少(P=0.0039），和Tsc1在耗尽中适度耗尽(P=0.13；图1D)，表示Tsc2-ICB治疗可能很脆弱。
TSC2缺乏上调肺癌细胞系PD-L1的表达
为了证实体外CRISPR筛选的结果，我们用单个sgRNAs转染肺癌细胞株Tsc1或Tsc2流式细胞仪分析显示Tsc2KP细胞膜Pd-l1表达水平显著升高(P<0.001；图2A以及图S1，A至C）。我们还建立了克隆Tsc2–敲除（KO）KP细胞系和三个单独的sgRNAs，并通过Sanger测序证实了基因组编辑的效率（图S2，A到I）。流式细胞术分析显示Pd-l1在大鼠脑内的表达Tsc2-KO-KP克隆比转染Ctrl-sgRNAs的克隆高(图2B).TSC2-缺失介导的PD-L1表达上调在人A549肺癌细胞系中也得到证实(图2C以及图S3，A到E）。接下来，我们救了KP-Tsc2-转染人KO细胞株TSC2编码序列，发现人TSC2再表达后Pd-l1的表达水平被显著抑制(图2D以及图S4）。此外，定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析显示，KP的Pd-l1mrna水平显著高于对照组-Tsc2-KO细胞明显高于对照细胞(P<0.01；图2E)，表示Tsc2在转录水平调控Pd-l1的表达。表达的缺失Tsc1KP细胞中Pd-l1的表达也显著增加(图2F以及图S5）。
图2.Tsc2-KO促进肺癌细胞PD-L1的表达。
(A)转染sgRNA的KP-Cas9细胞膜PD-L1的表达Tsc2. (B)细胞膜PD-L1在KP克隆中的表达-Tsc2-（A）中的KO细胞。(C)人A549克隆细胞膜PD-L1的表达-TSC2-KO细胞。(D)细胞膜PD-L1在KP中的表达-Tsc2-转染载体或人的KO细胞TSC2编码顺序（CDS）。(E)转染sgRNA的KP-Cas9细胞Pd-l1mrna水平的实时PCR分析Tsc2. (F)用Ctrl-KPPD转染的细胞在SGL1-KPPD细胞中表达Tsc1. (G)Tsc2-在体外杀伤实验中，KP-Ova细胞中的KO能显著抑制OT-1t细胞的杀伤活性，但添加抗PD-1抗体不能逆转这种抑制作用。(H)流式细胞仪显示Tsc2-在体外杀伤试验中，KO不增加卵母细胞膜和H-2的水平。数据显示为平均值±SEM*P<0.05**P<0.01***P<0.001，以及****P<0.0001。n、 不显著；aPD-1，抗PD-1抗体。
我们进一步在KP（KP-Ova）细胞系中构建性表达新抗原卵清蛋白，使KP-Ova细胞表达减弱Tsc2（图S6），然后与OT-1 T细胞共培养。体外杀伤实验表明，OT-1T细胞对细胞的毒性显著降低Tsc2-KO KP电池Tsc2野生细胞（WT）；然而，在共培养体系中加入抗PD-1抗体不能逆转这种细胞毒性的抑制作用(图2G)此外，流式细胞术显示Tsc2在共培养体系中，KP细胞不通过主要组织相容性复合物分子（H-2）增加肿瘤抗原表达（Ova）或提呈(图2H)这些发现表明，该机制可能不是通过PD-1/PD-L1轴或新抗原呈递介导的，未来的研究是有必要的。
TSC2NSCLC患者免疫检查点分子表达的缺失与预后不良有关
调查TSC1/TSC2突变状态和PD-L1表达水平，我们分析了复旦大学上海肿瘤中心（FUSCC）NGS队列非小细胞肺癌手术切除患者的数据。TSC1/TSC2-突变型NSCLC的PD-L1阳性率显著增高[肿瘤比例评分（TPS）]≥1%]比率（19/38，50.0%）与TSC1/TSC2-WT肿瘤（255/827，30.8%），而PD-L1阳性率TSC1/TSC2-扩增肿瘤明显较低（15例中有1例为6.7%），如图所示图3A.除PD-L1外TSC2对TCGA数据集中的其他非PD-L1免疫检查点也进行了分析和总结图3B结果显示，大鼠肺组织中的mRNA水平呈显著的负相关TSC2免疫检查点，包括PD-L1和T细胞免疫球蛋白和含蛋白3的粘蛋白结构域（TIM-3）（Spearman相关性，P<0.0001；图3、B和C)接下来，我们构建了一个组织微阵列（TMA），包括164例在FUSCC接受完全手术切除的NSCLC患者，其临床和病理特征如表S1所示。PD-L1和TSC2显示了一个非常高的HPD-L1得分(P=0.0098；图3D)还有提姆-3(P=0.028；图3E)蛋白质TSC2–低表达患者TSC2–高表达患者，验证先前的发现TSC2丢失与PD-L1和TIM-3上调有关。具有代表性的免疫组化图像TSC2在非小细胞肺癌患者中，PD-L1和TIM-3的表达图3F.
图3.相关性TSC2病人样本中有免疫检查点。
(A)PD-L1阳性（TPS）的比较≥1%）感染率TSC1/TSC2-突变体，TSC1/TSC2-WT，或TSC1/TSC2-FUSCC-NGS队列中的扩增肿瘤。费舍尔精确检验法。(B)TCGA数据集中TSC2和免疫检查点mRNA水平之间的Spearman相关性总结。(C)（B）TSC2与PD-L1及TIM-3mrna水平的Spearman相关性。(D和E)TSC2与PD-L1（D）和TIM-3（E）表达水平的相关性HFUSCC-TMA队列免疫组化评分。数据显示为平均值±SEM。(F)（D）和（E）中TSC2、PD-L1和TIM-3的免疫组化（IHC）图像。(G)在FUSCC-TMA队列中按TSC2蛋白表达水平分层的RFS。(H)从KM绘图仪获得的NSCLC数据集中，TSC2（215735μU s_at）和TSC1（209390_at）mRNA水平与总生存率（OS）的关系*P<0.05和**P<0.01。吲哚胺2,3-二氧杂合酶；LAG3，淋巴细胞活化基因3；CTLA4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4；甲型肝炎病毒细胞受体2；HR，危险比。
最后，我们进行了Kaplan-Meier（KM）分析，发现无复发生存期（RFS）低表达的患者TSC2型明显低于高表达组TSC2（3年RFS，54.1%对73.1%；对数秩检验，P=0.018；图3G)此外，KM绘图仪(http://kmplot.com/analysis/)发现低mRNA水平TSC2或TSC1分别与非小细胞肺癌患者总生存率下降显著相关(图3H)肿瘤的免疫抑制作用TSC2肿瘤免疫功能的丧失可能是导致患者预后不良的重要原因。
TSC2肺癌患者样本中的缺失与炎症微环境有关
系统地描述TSC2-失去NSCLC时，我们用定时器2.0来评估TSC2mRNA水平和主要免疫细胞亚型的各种算法。如中所述图4A,TSC2mRNA水平与CD8浸润呈负相关+T细胞，CD4+T细胞、调节性T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞（调节肿瘤纯度）。值得注意的是，与CD8的相关性+T细胞在我们使用的四种算法中都有统计学意义。从MCP计数器导出的散点图显示在图4B。以确认TSC2和CD8+T细胞作为定时器2.0显示，我们对164例NSCLC患者的TMA进行了免疫组化（IHC），发现TSC2–低表达肿瘤的CD8A也显著增加(P<0.05；图4，C和D)。此外，TSC2TCGA数据库中CD8A、CD8B、颗粒酶a（GZMA）、颗粒酶B（GZMB）、穿孔素1（PRF1）和C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10）水平呈显著负相关(图3E)根据PD-L1表达和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的存在与否，将TME分为四种类型(9,10)。以进一步调查TSC2在TME上，我们分析了TCGA数据集并定义了highTSC2PD-L1和CD8A的表达高于中位数。PD-L1的比例高的/CD8A型高的占41.4%TSC2低的组中，显著高于28.2%TSC2高的集团(P<0.01；图4F)，表示TSC2-丢失肿瘤表现为炎症性TME，已被证明与免疫治疗的益处有关(9,10).
图4TM2重新编程损失。
(A)TSC2水平与免疫滤液的相关性。数据来自定时器2.0(http://timer.comp-genomics.org/)。黄色突出显示表示统计显著性。T规则，调节性T细胞；NK，自然杀手；TH辅助性T细胞2；树突状细胞。(B)tsc2mrna水平与CD8的相关性研究+（A）中的MCP计数T细胞。(C)TSC2和CD8A表达水平的相关性HFUSCC-TMA队列免疫组化评分。数据显示为平均值±SEM。(D)（C）中CD8A的代表性图像。(E)TCGA数据集中TSC2与T细胞活化标记物水平的相关性总结。(F)TCGA数据集TSC2水平对PD-L1和CD8A分类免疫表型的比较。(G)比较CD8的条形图+/CD3型+CD8中的比率和PD-1 MFI+小鼠synkpic细胞模型(n=每组4个）。(H)比较CD8的条形图+/CD3型+CD8中的比率和PD-1 MFI+非小细胞肺癌患者的T细胞(TSC1/TSC2-变种人，n=5；TSC1/TSC2-重量，n=15）。(我)比较CD8细胞凋亡率和Ki-67mfi的条形图+KP同基因小鼠模型中的T细胞。(J)CD8中Ki-67 MFI的条形图比较+非小细胞肺癌患者的T细胞。(K)更高的突变负荷和预测的新抗原负荷TSC1/TSC2-TCGA和Hellmann数据集中的突变患者。方块图和触须图显示中位数和95%置信区间*P<0.05和**P<0.01。TPM，百万分之一的成绩单。
我们进一步对KP同基因小鼠模型和肺癌患者的肿瘤进行流式细胞术。与对照组比较，KP-Tsc2-KO肿瘤CD8的百分率明显增高+T细胞(P<0.01）和较高的PD-1平均荧光强度（MFI）+KP同基因小鼠模型中的T细胞(n=每组4个，P<0.05；图4G)在对非小细胞肺癌患者的肿瘤进行前瞻性的细胞术分析中，我们发现五种肿瘤具有TSC1或TSC2而且这些肿瘤的CD8也显著增加+/CD3型+CD8的比率和较高的PD-1 MFI+T细胞比TSC1/TSC2-WT肿瘤(n=15，P<0.01；图4H).
然后，我们探讨了肿瘤浸润CD8增加的机制+T细胞TSC1/TSC2-变异性肿瘤。在KP同基因小鼠模型中，CD8细胞凋亡率明显高于KP同基因小鼠+KP组T细胞明显减少-Tsc2-KO肿瘤(P<0.05），而Ki-67 MFI在两组间相似(图4I)由于细胞凋亡检测不包括在NSCLC患者样本的细胞术方案中，因此我们无法比较细胞凋亡。CD8的增殖水平+T细胞在TSC1/TSC2-突变体和TSC1/TSC2-WT非小细胞肺癌(图4J)结果表明，CD8细胞凋亡+T细胞被抑制TSC1/TSC2-失去肿瘤。
最后，我们分析了TCGA数据集的突变计数，发现TCGA数据集的突变负载显著高于TCGA数据集TSC1/TSC2-突变性肿瘤[P<0.01，错误发现率（FDR）=0.11；图4K]我们进一步分析了75例非小细胞肺癌患者的数据(11)发现非同步突变负荷和预测的新抗原都增加了TSC1/TSC2-突变型肿瘤（两者P<0.01，FDR=0.016；图4K).集体而言，TSC2NSCLC中的缺失与肿瘤突变负荷（TMB）和促进T细胞活化有关。
TSC1/TSC2-免疫治疗对小鼠同基因模型和患者群肿瘤的益处
先前的研究结果表明TSC1/TSC2loss是一组预后不良的NSCLC患者，也是一个不可治疗的靶点(12)以TIL和PD-L1表达为特征的炎性TME肿瘤，已被证明对ICB治疗更有反应。因此，我们使用KP小鼠同基因肺癌模型来验证以下假设：Tsc2-缺陷肿瘤对免疫治疗更敏感。为Tsc2-完整的肿瘤，抗PD-1抗体治疗对肿瘤生长有一定的抑制作用，无统计学意义。为Tsc2-与载体相比，KO肿瘤、抗PD-1抗体治疗显著降低肿瘤生长(P<0.05；图5，A至C)值得注意的是Tsc2-抗PD-1抗体治疗后KO肿瘤完全消退(图5、B和C).
图5在同基因小鼠模型和患者中，TSC1/TSC2丢失肺癌受益于ICB。
(A)皮下注射KP-ctrl或KP-Tsc2-KO同种异体肿瘤的抗PD-1抗体治疗。数据以平均值±SEM表示，并通过重复测量方差分析（ANOVA）进行比较。(B)水滴图显示肿瘤体积变化对治疗的反应（A）。每个条形图代表一个肿瘤。(C)（A）治疗终点的肿瘤体积。数据显示为平均值±SEM。(D和E)在接受免疫治疗的75例NSCLC患者中，TSC1/TSC2突变与较高的持续临床受益率（DCB）和无进展生存率（PFS）（E）相关。NDB，没有持久的好处。(F)75例非小细胞肺癌患者的个体PFS及其临床获益、性别、吸烟状况、组织学、TMB和新抗原负荷。(G)复发患者的计算机断层扫描（CT）图像TSC1-pembrolizumab和化疗前后的突变型肺腺癌。q3W，每3周一次*P<0.05。
接下来，我们分析了来自Hellmann CheckMate-012试验的75例NSCLC患者的数据等等。(11).在5名携带TSC1和/或TSC2，4名患者显示了持久的临床益处，而只有47%的患者TSC1/TSC2-WT肿瘤显示出临床益处(图5D)此外，突变TSC1和/或TSC2与高无进展生存率相关，尽管由于样本量有限，没有达到统计学意义(图5E)75例非小细胞肺癌患者的个体无进展生存率（PFS）及其临床益处、性别、吸烟状况、组织学、TMB和新抗原负荷总结如下图5F.
最后，我们检索了接受抗PD-1/PD-L1免疫治疗的患者，并确定了一名患者TSC1K629M突变。该患者，男性，68岁，曾吸烟，2013年11月接受电视胸腔镜手术左上叶切除术和纵隔淋巴结切除术，组织学检查显示实性优势腺癌（pT1bN0M0）。2019年3月，他被诊断为左肺和右胸膜疾病复发，经细胞病理证实。他于2019年5月开始每3周服用200mg培布罗珠单抗联合6个周期的顺铂和紫杉醇治疗，持续29个月，在2021年10月的最新随访中，没有进展或活动性疾病的迹象(图5G)这些发现表明TSC1/TSC2-尽管ICB治疗肺癌具有侵袭性的生物学行为和不良的预后，但ICB治疗仍可能使其受益。
讨论
通过对KP肺癌模型的体外和体内CRISPR筛选，我们确定Tsc1和Tsc2作为抗肿瘤免疫和ICB治疗敏感性的调节因子。TSC1型/TSC2-缺陷性肿瘤表现为明显的炎性TME，表现为免疫检查点的表达和T细胞的积聚。TSC1/TSC2丧失表现为适应性免疫抵抗状态和高免疫原性，因此，作为受益于ICB治疗的潜在生物标志物。
这个TSC1/TSC2复合物整合了多种信号通路的信号，通过调节mTOR通路来控制细胞的代谢和生长(13).TSC1和TSC2其功能为TSGs，其突变是NSCLC常见的遗传事件，发生频率为2～7%。这些突变大多是失活突变，导致蛋白质表达的丧失(14)，这使得TSC1/TSC2非小细胞肺癌的不良治疗靶点。我们的CRISPR筛选研究揭示了TSC1/TSC2突变与抗肿瘤免疫。因此，在本研究中，我们进行了全面的分析，揭示了炎症性颞下颌关节炎TSC1/TSC2-失去NSCLC。
体外筛选结果表明，sgRNAs的表达Tsc1和Tsc2在Pd-l1-高亚群中显著富集，表明Tsc1/Tsc2缺失促进Pd-l1表达。这一发现在肺癌细胞系和病人样本中都得到了证实。特别是，我们分析了一个NGS队列和一个TMA-IHC队列，分析了接受FUSCC手术切除的NSCLC患者的突变状态和蛋白表达TSC1/TSC2与PD-L1表达显著相关。此外，我们发现TSC2在转录水平上调肺癌细胞PD-L1。相比之下，Lastwika等等。(15)显示mTOR的下游靶点TSC1/TSC2，在翻译水平增加PD-L1的表达。这表明TSC1/TSC2可能通过mTOR依赖和mTOR非依赖途径在mRNA和蛋白质水平上控制PD-L1的表达。
除了上调PD-L1的表达，失活TSC1/TSC2同时通过增加CD8的募集来重新规划免疫微环境+T细胞。PD-L1表达由TSC1/TSC2T细胞缺乏抑制了细胞毒性作用。我们还发现TSC1/TSC2突变增强了其他一些免疫抑制检查点的表达水平，包括PD-1和TIM-3。渗透性CD8+这些检查点介导的T细胞处于衰竭状态，形成免疫抑制的微环境，实现肿瘤细胞的免疫逃避。据报道，TIM-3上调可介导抗PD-1免疫治疗的耐药性(16)联合治疗阻断PD-1和TIM-3通路可能对TSC1/TSC2-缺陷性肿瘤。未来的临床前研究和临床试验需要进一步的研究。
我们的分析也发现TSC1/TSC2-突变型NSCLC的TMB明显增高。多个研究表明，TMB可能是新抗原总负荷的替代物，并且能够有力地预测ICB的临床益处(11,17).先前的研究表明TSC1/TSC2型丢失和DNA损伤反应（DDR）系统。机械上，损失TSC2过度激活mTORC1信号并降低参与DNA双链断裂修复的RNF168蛋白的丰度，导致DDR缺陷和基因突变的积累(18).
总之，我们从细胞系、同基因小鼠模型和非小细胞肺癌患者标本中获得的数据显示了TSC1/TSC2突变促进PD-L1表达，促进T细胞浸润和增强肿瘤免疫原性。这项工作证明TSC1/TSC2-突变型NSCLC可从ICB治疗中获益，突出了ICB对NSCLC的预测价值TSC1/TSC2免疫治疗的指导地位。
材料和方法
细胞培养与慢病毒感染
人胚肾（HEK）293T细胞系在含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。小鼠KrasG12D型/p53基因?/?（KP）肺癌细胞系（C57BL/6背景）的建立和特性如前所述(19)在含10%FBS的RPMI 1640（Gibco）中培养。
慢病毒包埋及感染方法如下：将HEK-293T细胞与pLenti-Cas9-puro、pXPR-GFP-Blast-sgRNA或lentiCRISPR-v2构建和包装质粒PSPAX2和PMD2共转染HEK-293T细胞。G使用脂质体3000（Invitrogen）。将HEK-293T细胞释放的子代病毒用0.45μm过滤器（Corning）过滤，并在含有病毒颗粒的细胞培养基中加入聚布伦（Sigma-Aldrich）以提高感染效果。选择稳定的细胞株，并在嘌呤霉素（2μg/ml）或芽孢霉素（5μg/ml）中保存。为抢救实验，质粒pcDNA3。1小时TSC2购自上海亚维生物科技有限公司（目录号2497）。老鼠Tsc2基因与人类有高度的同源性(20)人TSC2的编码序列不包含小鼠的三个sgRNA的靶序列Tsc2.
CRISPR筛选
慢病毒sgRNA库的构建，包括Tsc1和Tsc2，用于CRISPR筛选之前已经描述过(6)文库中每个基因有8到12个sgRNAs。两个KP-Cas9克隆（克隆7和9）的Cas9表达被Western blot（WB）证实，在0.2倍的感染倍数下，由文库产生的慢病毒转化，其覆盖率至少为1000倍。在体外筛选方面，我们使用流式细胞术对培养皿中2周后的前15%PD-L1-高群和前15%PD-L1-低群进行分类。在体内筛选时，将转化的KP细胞皮下移植到C57BL/6小鼠体内，在第7天用抗PD-1抗体或同型对照（每周3次）进行治疗；第24天取肿瘤(6)分类后的细胞池和收获的肿瘤进行基因组DNA提取（DNA血Midi试剂盒，QIAGEN），sgRNA扩增，并在Illumina HiSeq上测定sgRNA的丰度。sgRNA的靶序列如表S2所示。
流式细胞术
每种情况下采集100万个细胞，并在含有2%FBS的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重新悬浮。细胞颗粒用PD-L1抗体（克隆10F.9G2，BioLegend）在PBS和2%FBS中稀释30分钟，在冰上染色。细胞在BD Biosciences LSRFortessa上成像，并用FlowJo软件进行分析。
实时定量聚合酶链反应
qRT-PCR如前所述进行(6)使用实时PCR系统的StepOneSystems。所有反应一式三份。引物序列如下：Pd-l1（小鼠）、5′-ACTTGCTAGGGCGTTTACT（正向）和5′-ACTAACGCAGCAGGTCAG（反向）；肌动蛋白（小鼠），5′-ctgtccctgtatgcctg（正向）和5′-atgTcCcCcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcT。
WB和IHC
细胞在冰上用含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fisher Scientific）的放射免疫沉淀试验缓冲液对细胞进行裂解。蛋白质裂解物用4～12%双三硅凝胶（Invitrogen）分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。在膜被阻断后，用抗TSC2[D93F12，细胞信号技术（CST）]和β-肌动蛋白（Ab8227，Abcam）的抗体在4℃下进行免疫印迹。IRDye 800标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）和IRDye 680标记的山羊抗小鼠IgG二级抗体购自LI-COR Biosciences，并使用Odyssey检测系统（LI-COR Biosciences）检测膜。
我们构建了一个由880例非小细胞肺癌患者组成的队列，这些患者的切除标本通过FUSCC靶向NGS进行了分析（FUSCC-NGS队列）。我们从病历中检索了包括PD-l1tps（22C3）在内的临床病理信息，并比较了PD-l1tps的突变状态TSC1/TSC2另外，我们对164例非小细胞肺癌患者进行了完全手术切除，并用每个切除标本的一个肿瘤块（FUSCC-TMA队列）的1.5mm核构建了TMA。在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中通过微波处理制备抗原回收的组织切片与抗TSC2（D93F12，CST）、抗PD-L1（E1L3N，CST）、抗TIM-3（D5D5R，CST）和抗CD8A（D8A8Y，CST）一级抗体孵育。免疫染色在显微镜下用二氨基联苯胺溶液染色，苏木精复染。
这项研究得到了FUSCC机构审查委员会的批准。每位患者均获得知情同意。
体外杀灭试验
我们用基因方法产生了一个KP-Ova细胞系。KPOVA公司-Tsc2-KO细胞或KP-Ova-Ctrl细胞与OT-1t细胞以1:3的比例（0.05万个肿瘤细胞：15万个OT-1t细胞）在96孔平板上共培养。共培养2天后，用PBS冲洗OT-1t细胞，用细胞计数试剂盒8（ALX-850-039-KI02，Enzo）检测肿瘤细胞活性。对照组为0.05万KP Ova-Tsc2-KO细胞或KP-Ova-Ctrl细胞在没有OT-1t细胞的情况下培养2天。相对细胞活性=存在OT-1 T细胞时肿瘤细胞的光密度（OD）平均值/无OT-1 T细胞时肿瘤细胞的OD平均值×100%。
小鼠治疗研究
所有的老鼠研究都经过纽约大学医学院动物护理和使用委员会或达纳法伯癌症研究所的审查和批准。专门的无病原体设施被用来安置和照顾所有的老鼠。细胞被皮下注射到6到8周大的C57BL/6小鼠体内（Jackson实验室）。小鼠抗PD-1抗体（29F.1A12）(21)或同型对照组每周三次（星期一、星期三和星期五），每只小鼠腹腔注射200μg。用卡尺测量肿瘤最大长度和宽度，每周两次。肿瘤体积按以下公式计算：(我×W2)/2。
统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism 7进行。数据由学生的t曼惠特尼测试美国根据需要进行测试。用KM法绘制生存曲线，并用对数秩检验进行比较。TCGA的3级数据通过TCGA门户获得，并根据突变状态或表达水平进行排序TSC1和TSC2用KM绘图仪对NSCLC患者的mRNA表达水平与生存期进行了相关性研究(http://kmplot.com/analysis/) (22).P<0.05（双尾）被认为具有统计学意义(*P<0.05**P<0.01***P<0.001，以及****P<0.0001）。
