光动力基因调控新策略：补骨脂素偶联三链形成寡核苷酸(OPTO)的设计与功能评估

为解决传统三链形成寡核苷酸(TFO)因嘧啶碱基中断导致的靶向局限性，日本研究人员开发了1'-补骨脂素偶联三链形成寡核苷酸(OPTO)。该技术通过补骨脂素(psoralen)嵌入增强三链体热力学稳定性，结合锁核酸(LNA)和5-甲基胞嘧啶(5mC)修饰，成功在生理条件下靶向HTLV-1病毒5'-LTR区含嘧啶中断的序列，并实现高效光交联。发表于《Communications Chemistry》的研究为扩展TFO在基因编辑和光动力治疗中的应用提供了新工具。

　　

在基因调控领域，三链形成寡核苷酸(Triplex-forming oligonucleotides, TFO)因其能特异性结合双链DNA形成三螺旋结构而备受关注。这种技术通过阻断转录因子结合或诱导DNA双链断裂(DSB)，在基因沉默和基因组编辑中展现出巨大潜力。然而，传统TFO面临两大瓶颈：一是依赖连续的嘌呤序列，靶向范围受限；二是生理条件下平行三链体(parallel triplex)稳定性差，尤其当靶序列出现嘧啶碱基中断时，热力学稳定性会急剧下降。

针对这些挑战，日本大阪大学的研究团队在《Communications Chemistry》发表了一项突破性研究。他们设计了一种新型1'-补骨脂素偶联三链形成寡核苷酸(1'-psoralen-conjugated triplex-forming oligonucleotide, OPTO)，通过将补骨脂素(psoralen)这一光交联剂精准定位在嘧啶中断位点，结合锁核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)和5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)修饰，成功实现了在生理条件下对含嘧啶中断序列的高效靶向。

研究团队采用了多学科交叉的技术路线：通过有机合成构建1'-补骨脂素脱氧核糖(P)这一新型核苷类似物；利用紫外熔解曲线(UV-melting)测定三链体解链温度(T_m)；采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)验证复合物稳定性；最后通过变性PAGE评估光交联效率。

研究结果展现出三大创新点：

1. 分子设计突破：将补骨脂素连接在脱氧核糖1'-位点，形成空间优化的"楔形"结构。如图2所示，这种设计使补骨脂素能更深入嵌入DNA双链，在pH 5.3条件下将三链体T_m提升4°C。

   

2. 协同稳定效应：LNA与5mC的联合应用产生显著协同效应。如图4所示，在pH 7.0条件下，含单个P的L-OPTO1使T_m跃升至45°C，而双P修饰的L-OPTO3更达到50°C，远超常规TFO的36°C。Native PAGE证实这些复合物在37°C下仍保持稳定。

   

3. 广谱靶向能力：如图5所示，OPTO技术成功应用于HTLV-1病毒5'-LTR区等多个含嘧啶中断的靶序列，证明其设计具有普适性。光交联实验显示，含多个补骨脂素的L-OPTO4在1秒照射内即可形成47%的交联产物，效率与P数量呈正相关。

这项研究的科学意义在于：首先，突破了传统TFO的序列限制，将靶向范围扩展至含嘧啶中断的基因组区域；其次，通过补骨脂素的光交联特性，为时空精确的基因调控提供了新工具；最后，针对HTLV-1病毒等难治性疾病，提供了区别于CRISPR的核酸药物开发新思路。正如作者Yu Mikame和Asako Yamayoshi强调的，这种"化学修饰-结构优化-功能验证"的研究范式，为发展下一代基因靶向技术开辟了道路。未来，该技术有望在抗病毒治疗、表观遗传调控和精准医学等领域产生深远影响。