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拉克他霉素（Lactacystin）是一种从链霉菌中分离出的不可逆蛋白酶体（proteasome）抑制剂，其生物合成机制此前未知。研究人员通过基因敲除和异源表达等实验，明确了其生物合成基因簇及相关基因功能，为开发新型相关抑制剂奠定基础。
在生命科学的神秘领域中，蛋白酶体如同精密的分子机器，掌控着细胞内蛋白质的降解过程，对细胞的正常运作起着关键作用。拉克他霉素（Lactacystin）作为一种强大的蛋白酶体抑制剂，自 1991 年从链霉菌（Streptomyces lactacystinicus）中被分离出来后，便因其在研究蛋白酶体功能和机制方面的重要价值而备受关注。它能不可逆地结合到蛋白酶体的 β 亚基 N 端苏氨酸（Thr）残基上，阻断蛋白酶体的蛋白质降解活性，就像给分子机器塞进了一颗 “小石子”，使其无法正常运转。
然而，这颗 “神奇小石子” 的诞生过程却一直笼罩在神秘的面纱之下。尽管此前有一些关于其生物合成前体的研究，比如通过稳定同位素标记化合物的喂养实验，推测出甲基丙二酸半醛和亮氨酸（Leu）可能是其构建模块，但对于负责合成拉克他霉素的基因和酶，科学界几乎一无所知。这种知识的空白，严重限制了对拉克他霉素生物合成途径的深入理解，也阻碍了基于其结构开发新型蛋白酶体抑制剂的步伐。
为了揭开拉克他霉素生物合成的神秘面纱，来自北海道大学（Graduate School of Engineering, Hokkaido University）和福井县立大学（Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Fukui Prefectural University）的研究人员展开了一场科学探索之旅。他们通过一系列精心设计的实验，最终成功解开了这个谜团，相关研究成果发表在《Communications Chemistry》上。这一突破为开发新型拉克他霉素相关的蛋白酶体抑制剂提供了关键的理论基础，有望在生物医学领域引发新的变革。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。基因编辑技术是其中的重要手段，通过基因敲除（gene disruption）特定基因，观察其对拉克他霉素合成的影响，以此确定基因与合成过程的关联性。异源表达（heterologous expression）实验则是将相关基因片段导入其他菌株，验证这些基因是否能指导合成拉克他霉素。此外，体外实验（in vitro experiments）用于深入研究单个酶的功能，通过分析反应产物来揭示酶在生物合成途径中的具体作用。
拉克他霉素生物合成基因簇的鉴定
研究人员首先对拉克他霉素产生菌 S. lactacystinicus NBRC 110082 进行了基因组草图分析。基于拉克他霉素的化学结构和先前的示踪实验结果，他们推测其核心结构由聚酮合酶 - 非核糖体肽合成酶（PKS-NRPS）系统形成。通过搜索 PKS-NRPS 杂合蛋白，他们发现了一个候选基因区域，该区域周围的基因与盐孢菌素 A（salinosporamide A）生物合成基因簇中的基因相似，其中还包含与 γ- 内酰胺 - β- 内酯结构形成相关的 salC 基因的同源物。为了验证该区域是否参与拉克他霉素的生物合成，研究人员敲除了编码细胞色素 P450（CYP450）的 lctD 基因。结果发现，敲除后的菌株失去了合成拉克他霉素的能力，并且积累了一种比拉克他霉素质量少 16 个单位的化合物，推测为去羟基拉克他霉素。随后的异源表达实验进一步表明，LctA - LctF 在拉克他霉素的生物合成中起着至关重要的作用，而 LctT 和 LctH 可能对高产率合成具有重要意义。
拉克他霉素的推测生物合成途径
综合上述实验结果和计算机分析，研究人员推测出了拉克他霉素的生物合成途径。首先，甲酰基转移酶（LctF）将 10-N - 甲酰基四氢叶酸（10N-fTHF）的甲酰基转移到辅酶 A（CoA）上，形成甲酰基 - CoA。接着，LctA 的 AT1 结构域将甲酰基转移到酰基载体蛋白 1（ACP1）上，同时 AT2 结构域将甲基丙二酰基从甲基丙二酰 - CoA 加载到 ACP2 上。然后，LctA 的酮合酶（KS）结构域催化克莱森缩合反应，形成与 ACP2 相连的甲基丙二酸半醛。LctB 的腺苷化（A）结构域在激活亮氨酸（Leu）或 3 - 羟基亮氨酸（OH-Leu）后，将其加载到肽酰载体蛋白（PCP）结构域上，MbtH 样蛋白（LctE）可能与 A 结构域相互作用并激活它。之后，与 ACP2 相连的化合物 3 和与 PCP 结合的 Leu 或 OH-Leu 在 LctA 的缩合（C）结构域作用下缩合形成中间体。最后，由独立的酮合酶样环化酶（LctC）催化中间体环化并释放产物，再经过自发添加 N - 乙酰半胱氨酸，最终形成拉克他霉素。
LctA 中 ACP1 和 AT1 对拉克他霉素生物合成至关重要
LctA 独特的结构引起了研究人员的关注，其 ACP1 结构域位于首位、C 结构域位于末位的情况在 PKS-NRPS 杂合酶中较为罕见，且 AT1 结构域的底物难以通过氨基酸序列预测。为了探究 ACP1 和 AT1 的功能，研究人员构建了分别使 ACP1 和 AT1 失活的突变体。实验结果显示，两种突变体菌株均失去了合成拉克他霉素的能力，这表明 AT1 和 ACP1 对于拉克他霉素的生物合成是必不可少的。
甲酰基转移酶（LctF）催化甲酰基 - CoA 的形成
研究人员对 LctF 进行了体外分析，发现它与蛋氨酰 - tRNA 甲酰基转移酶有 32% 的同一性。通过一系列复杂的步骤制备 10N-fTHF 后，研究人员将重组 LctF 与 CoA 在 10N-fTHF 存在的条件下进行反应。LC-ESI-MS 分析表明，只有在 LctF 和 10N-fTHF 同时存在时，才能检测到与化学合成的甲酰基 - CoA 保留时间和质荷比相同的特定峰，这证明 LctF 能够以 10N-fTHF 为辅助因子，催化甲酰基转移到 CoA 上，这是一种全新的甲酰基 - CoA 生物合成途径。
LctA_AT1 识别甲酰基 - CoA 并将甲酰基转移至 ACP1
体外实验表明，LctA_AT1 能够特异性地识别甲酰基 - CoA，并将甲酰基转移到 ACP1 上，形成甲酰化的 ACP1，这是首次发现 AT 结构域能够识别甲酰基 - CoA 作为底物。通过与盐孢菌素 A 生物合成中 SalA_AT1 的对比研究，发现 LctA_AT1 的底物结合口袋较小，这使得它只能识别较小的甲酰基 - CoA，而不能识别乙酰 - CoA。对 LctA_AT1 进行定点突变后，其突变体 M-LctA_AT1 能够同时接受甲酰基 - CoA 和乙酰 - CoA，且对后者的接受效率更高，进一步证实了决定底物特异性的关键氨基酸残基的作用。
LctB 中 NRPS 的腺苷化结构域的体外分析
由于拉克他霉素的羟基对其生物活性具有重要影响，研究人员对 LctB 的 A 结构域底物特异性进行了研究。由于全长 LctB 难以表达，研究人员制备了截短的 A 结构域和重组的 LctE 蛋白。实验结果表明，A 结构域对 Leu 的腺苷化活性比对 OH-Leu 高 10 倍，且在 LctE 存在时活性显著增强。此外，只有 Leu 能够被转移到 PCP 结构域，这表明 Leu 是 LctB 的底物，且羟基化可能发生在生物合成的后期步骤。
酮合酶样环化酶（LctC）的体外分析
为了研究拉克他霉素生物合成的最后一步酶促反应，研究人员对 LctC 的功能进行了探究。LctC 与负责盐孢菌素 A 生物合成的 SalC 具有 66% 的同一性。研究人员合成了一种模拟底物，并将其与 LctC 孵育。LC-MS 分析显示，在 LctC 存在的情况下，发生了环化反应并伴随着产物从 PCP 上的释放，这表明 LctC 能够催化类似 SalC 的反应，尽管其使用的底物含有醛基而非酮基。
研究人员通过体内和体外实验，全面揭示了拉克他霉素的生物合成机制。他们鉴定出了生物合成基因簇，明确了各个基因编码的酶在合成过程中的具体功能，包括 LctF 催化甲酰基 - CoA 的形成、LctA_AT1 对甲酰基 - CoA 的特异性识别等关键步骤。这一研究成果不仅加深了人们对天然产物生物合成的理解，更为重要的是，为通过生物合成工程开发新型拉克他霉素相关的蛋白酶体抑制剂提供了坚实的理论基础，有望在未来的生物医学研究和药物开发领域发挥重要作用。
