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为解决现有大分子结构测定方法的局限，如 X 射线自由电子激光器（XFELs）样本消耗大、第三代同步加速器分辨率受限等问题，研究人员开展了基于第四代同步加速器 ID29 光束线的串行微秒晶体学（SμX）研究。结果表明 SμX 能高效获取高质量数据，该研究为结构生物学研究开辟新方向。
在生命科学研究的微观世界里，探索大分子结构如同解锁神秘宝藏的密码。大分子结构的精准测定对于理解生命过程、开发新型药物至关重要。传统的大分子结构测定方法，如在 X 射线自由电子激光器（XFELs）上进行的串行飞秒晶体学，虽然开启了新的研究方向，但它就像一个 “大胃王”，需要大量样本，实验装置复杂，而且使用成本高昂，限制了其广泛应用。第三代同步加速器的串行毫秒晶体学（SMX）虽然有所改进，但在分辨率上仍存在不足，就像戴着一副度数不够的眼镜看东西，总是模糊不清。此外，利用 “粉色光束” 的劳厄晶体学方法，在时间和空间分辨率的平衡上也面临挑战，难以清晰捕捉生物反应的细节。
为了突破这些困境，欧洲同步辐射设施（ESRF）的研究人员勇挑重担。他们在 ESRF 的第四代同步加速器升级项目中，精心打造了 ID29 光束线，并开展了基于此的串行微秒晶体学（SμX）研究。这一研究成果发表在《Communications Chemistry》上，为大分子结构解析领域带来了新的曙光。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是样本递送技术，采用固定靶（如箔片或硅芯片）和高粘度挤出器（HVEs）两种方式，确保样本能够稳定、高效地被 X 射线照射；其次是数据采集技术，利用 JUNGFRAU 4 M 探测器记录衍射数据，并通过内部开发的 LImA2 数据采集系统进行自动校正和几何重建；最后是数据处理技术，运用 CrystFEL-v0.10.1 套件进行斑点查找和索引，使用 Phaser 进行分子置换确定结构，借助 phenix.refine 和 COOT 进行结构精修和模型构建。
串行微秒数据采集
ID29 光束线设计独特，它就像一个强大的 “数据收集器”，能将 X 射线源的大部分亮度保留下来，并在样本位置提供比第三代同步加速器光束线高 3 - 4 个数量级的光子通量密度。X 射线束通过斩波器系统进行机械脉冲调制，产生 90 微秒的脉冲，重复频率为 231.25Hz。这种独特的设计使得在室温下进行结构研究有了新的突破方向。研究人员还开发了新的衍射仪 MD3upSSX，它能够与外部时钟同步数据采集序列，还可触发外部设备，为实验提供了更多可能性。同时，基于 MXCuBE - Web 开发的专用软件，大大方便了 SμX 数据的采集。
SμX 在高粘度挤出器上的应用
研究人员使用了三种不同类型的高粘度挤出器（ASU - HVE、MPI - HVE 和 SACLA - HVE），将嵌入羟乙基纤维素（HEC）基质中的奇异果甜蛋白微晶挤出。通过调整挤出速度，使样本在两个连续的 X 射线脉冲之间移动约 10 微米，确保样本充分更新。在这种条件下，每种 HVE 都能在约 35 分钟内收集 500,000 张图像，命中率较高，最终获得了分辨率为 1.75? 的高质量结构。这表明 ID29 实验装置通用性强，能有效应用于不同的样本递送系统。
SμX 在固定靶上的应用
在固定靶上进行数据采集时，研究人员通过在预定义区域以 S 形轨迹连续扫描来获取数据。新的 MD3upSSX 样本头能够实现快速光栅扫描数据采集，速度高达 125mm/s。研究人员使用了硅基牛津芯片和聚酯薄膜基片上片（SOS）三明治结构进行实验，通过研究不同间距对数据质量的影响发现，尽管间距不同，但数据的命中和索引率相似，20μm 间距可能是最佳的数据采集选项，最终都能在 2.0? 分辨率下精修结构。
SμX 有效突出配体电子密度
研究人员利用 SμX 研究了两种配体的结合情况。在溶菌酶 - N - 乙酰葡糖胺（HEWL - GlcNAc）体系中，通过记录两种溶菌酶微晶（apo 和预浸泡 GlcNAc）的衍射数据，计算同晶差值图，发现即使在解离常数（Kd）范围内，仅用 2,000 个合并帧就能获得可清晰解释的配体电子密度图。在腺苷受体（A2AR） - 伊斯特拉地尔（Istradefylline）体系中，A2AR 受体与伊斯特拉地尔共结晶，研究人员利用箔片减少样本消耗，仅用 15μL 晶体浆液就获得了 2.5? 分辨率的完整数据集，同样 2,000 个合并图像就足以获得清晰的配体电子密度图，并确定了伊斯特拉地尔的结合模式。
在研究结论和讨论部分，ID29 光束线的出现是大分子结构解析领域的重大突破。它克服了第三代同步加速器终端站的诸多限制，其独特的光束特性和实验装置，使得 SμX 能够在短时间内从少量晶体材料中获取高质量、完整的数据。短脉冲（90 微秒）的应用不仅提高了信噪比，还减少了辐射损伤，这对于研究室温下的大分子结构至关重要。此外，ID29 的通量密度独特，为研究高剂量率和脉冲光束对辐射的影响提供了机会，有助于推动未来串行晶体学光束线的设计。其灵活的样本环境设置，可集成多种样本递送技术，为自动化实验和高通量筛选奠定了基础。从更长远的角度看，SμX 有望应用于基于结构的药物发现项目，为制药行业和生物技术领域带来新的发展机遇。而且，即将在其他同步加速器上建设的类似光束线也计划采用 ID29 的概念，这将在全球范围内推动结构生物学研究进入一个新的时代，让我们对生命的微观奥秘有更深入、更准确的认识。
