植物乳杆菌胞质膜囊泡（CMVs）作为新型抗炎纳米疗法通过AEA介导巨噬细胞极化调控及氧化应激缓解治疗银屑病

本研究揭示了植物乳杆菌（Lp）源胞质膜囊泡（CMVs）通过富集内源性大麻素（AEA），多维度抑制巨噬细胞M1极化、角质细胞过度增殖及氧化应激，为银屑病提供了新型无细胞治疗策略，并建立了微生物组精准干预的功能筛选平台。

　　

1 引言

微生物组与宿主免疫的复杂相互作用重新定义了我们在共生生态系统框架内对健康和疾病的理解。菌群失调日益被认为是系统性炎症和免疫功能障碍的重要促成因素，为疾病机制和治疗机会提供了关键见解。这在慢性炎症性疾病中尤其相关，其中紊乱的微生物组，特别是有益的共生菌群减少，可能导致系统性炎症和免疫失衡。银屑病虽然被归类为自身免疫性疾病，但 exemplifies 了微生物组与疾病进展之间的密切关联。

银屑病患者表现出皮肤和肠道微生物多样性的显著减少，其特征是免疫调节菌属的耗竭，包括乳杆菌属（Lactobacillus）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和肠球菌属（Enterococcus），同时伴有致病菌的增殖，如葡萄球菌属（Staphylococcus）、沙门氏菌属（Salmonella）、螺杆菌属（Helicobacter）和念珠菌属（Candida），这些变化与疾病严重程度相关。尽管有这些进展，目前的益生菌策略在很大程度上仍然是经验性的，受限于对介导治疗效果的生物活性成分的不完全了解。

新兴共识认为，益生菌的功效源于细菌代谢物、细胞外囊泡（EVs）、细胞壁成分和分泌的生物分子的集合。虽然EVs因其免疫调节作用而备受关注，但比较来自同一细菌的不同生物活性成分之间异同的研究仍然匮乏。这一限制不仅阻碍了对EVs所提供优势的全面理解，也限制了对其他生物活性成分的潜在认识。

在本研究中，我们确定了乳杆菌物种丰度降低是包括银屑病在内的四种炎症性皮肤病的保守微生物特征。使用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, Lp）作为模型，我们分离了四种生物活性组分：胞质膜囊泡（CMVs）、细菌裂解上清（BL-S）、细菌裂解沉淀（BL-P）和无细胞发酵上清（CFS），以剖析它们的免疫调节特性。

2 结果

2.1 乳杆菌属物种丰度降低与银屑病和其他炎症性皮肤病相关

为了研究银屑病患者肠道微生物组的改变，我们使用gutMDisorder在线数据库的数据比较了健康个体与银屑病患者的肠道 microbiota。银屑病患者差异 microbiota 的LEfSe分析显示，与健康受试者相比，9个物种显著增加，15个物种显著减少。其中，c_Bacilli、o_Lactobacillales、f_Lactobacteriaceae和g_Lactobacillus在银屑病患者中的丰度低于健康人群。

随后，我们在Disbiome在线数据库中详细分析了四种不同炎症性皮肤病患者（特应性皮炎、痤疮、婴儿湿疹和银屑病）的 microbiota。分析一致表明，在所有 these conditions 中，Lactobacillus spp. 的存在均减少。研究结果表明，Lactobacillus spp. 丰度降低是各种炎症性皮肤病微生物组的共同特征，表明乳杆菌属物种的减少可能在 these skin conditions 的维持和恶化中起重要作用。

为了鉴定具有治疗潜力的特定乳杆菌菌株，我们回顾了关于该属来源的细胞外囊泡（EVs）、裂解物和无细胞上清（CFS）治疗作用的文献。确定植物乳杆菌（L. plantarum, Lp）是最有治疗前景的物种。Lp EVs 已被证明具有免疫调节、抗炎和抗菌活性；Lp 裂解物显示出抗炎作用、增强皮肤屏障功能和具有抗菌特性；Lp CFS 显示抗氧化、抗菌和抗真菌活性。

2.2 Lp CMVs 和生物活性成分的制备和表征

鉴于 presented 结果，植物乳杆菌被确定为开发 further therapeutic approaches 的关键候选者。经过厌氧发酵培养后，通过不同的程序提取和制备了植物乳杆菌ATCC BAA-793的四种生物活性成分，即CMVs、BL-S、BL-P和CFS。

四种生物活性成分中包含的物质因其提取方案的不同而不同：CMVs从胞内分泌，BL-S和BL-P分别从细菌裂解物的上清和细胞沉淀中提取，CFS来源于发酵培养液。透射电子显微镜（TEM）观察到CMVs中典型的细胞外囊泡形态学标志——盘状双层膜结构。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，CMVs的颗粒大小均匀分布在179.8 nm左右，浓度约为1.137e+11颗粒/mL。此外，动态光散射（DLS）分析显示CMVs的平均Zeta电位为-24.14 mV，表明它们具有良好的稳定性。

2.3 Lp CMVs 抑制巨噬细胞的促炎M1极化

M1表型巨噬细胞被认为通过分泌促炎介质、参与抗原呈递和响应氧化应激，有助于炎症反应的升级和维持。同时，这些作用可能导致组织损伤和向慢性炎症的进展。作为大量浸润银屑病皮肤病变部位的先天免疫细胞，巨噬细胞通过分泌各种炎性细胞因子激活适应性免疫反应并诱导角质形成细胞的过度增殖和异常分化。

因此，我们最初的探索 focused on 评估植物乳杆菌生物活性成分对巨噬细胞引发的炎症反应的影响。在我们最初的调查中，我们观察到在四种生物活性成分中，只有10 μg/mL的BL-S使PMA诱导的THP-1巨噬细胞的基础增殖活性轻微增强了7.94%，而其他成分没有显著影响。在LPS诱导的巨噬细胞增殖模型中，CMVs以浓度依赖的方式显著抑制巨噬细胞增殖，在最高浓度时抑制率高达23.21%。BL-S仅在最低测试浓度（0.001 μg/mL）下表现出抑制，使增殖减少18.52%。相反，BL-P和CFS对LPS诱导的THP-1巨噬细胞增殖没有显示出抑制作用。

在用PMA将THP-1细胞分化为巨噬细胞后，我们评估了这些巨噬细胞在LPS诱导激活下暴露于植物乳杆菌的四种生物活性成分时的炎症反应。定量PCR分析显示，CMVs以浓度依赖的方式显著抑制促炎细胞因子的mRNA表达。具体而言，CMVs处理导致TNF-α（高达50.77%）、IL-6（高达54.20%）和IL-1β（高达88.44%）的显著减少。类似地，BL-S也在多个浓度下对TNF-α和IL-1β的表达表现出抑制作用，减少范围从33.79%到84.32%。值得注意的是，BL-S的最高和最低浓度显著抑制了TNF-α，而所有三个浓度都显著降低了IL-1β的表达。另一方面，BL-S对IL-6 mRNA表达的影响没有统计学意义。另一方面，BL-P和CFS都没有显示出对这些细胞因子的抑制作用；相反，它们要么没有影响，要么甚至增强了它们的表达。

M1巨噬细胞在银屑病持续炎症中的关键作用强调了需要评估已证实减少炎症介质表达的CMVs和BL-S是否也对巨噬细胞极化产生可比的影响。流式细胞术分析表明，CMVs处理导致LPS诱导的iBMDMs中CD11b⁺CD80⁺ M1促炎巨噬细胞比例的浓度依赖性减少。在较高浓度（≥ 10 μg/mL）下观察到显著抑制，最大减少54.45%。相比之下，BL-S对M1巨噬细胞的极化没有显著影响。

上述 presented 数据表明，在植物乳杆菌的四种生物活性成分中，CMVs在抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子和向M1促炎表型极化方面最为有效。另一方面，BL-S在减少巨噬细胞产生炎性细胞因子方面的效果仅次于CMVs。

2.4 Lp CMVs 在发炎角质形成细胞中发挥抗增殖和抗氧化作用

银屑病的发病机制因过度角化和由活性氧（ROS）产生增加驱动的氧化应激之间的正反馈循环而显著加剧，放大了局部炎症并导致疾病逐渐恶化。

在我们最初的调查中，我们评估了四种生物活性成分对角质形成细胞的潜在细胞毒性作用。研究结果表明，在基础条件下，只有0.1 μg/mL的BL-S使HaCaT细胞的增殖增强了18.23%，并且所有四种测试的生物活性成分对HaCaT细胞没有毒性，也没有显著阻碍其增殖能力。

在随后的实验阶段，我们通过引入TNF-α和IL-17复制了一个炎症环境。这种设置使我们能够进一步研究四种生物活性成分对角质形成细胞对炎症刺激的增殖反应的影响，即评估它们在炎症背景下调节过度角化的潜力。

在TNF-α和IL-17的炎症刺激下，CMVs显著抑制细胞增殖，在20 μg/mL时最大减少17.76%。BL-S也在多个浓度下抑制过度细胞增殖，最大抑制率为8.98%，尽管这种效应相对 modest。相反，BL-P和CFS均以浓度依赖的方式显著促进炎症增殖。BL-P使增殖增强高达10.13%，而CFS表现出更强的促增殖效应，在最高浓度时刺激达到30.38%。

鉴于ROS与银屑病炎症组织损伤之间 well-documented 的联系，我们继续研究了四种生物活性成分对炎症背景下升高的ROS水平的潜在影响。流式细胞术和定量分析表明，CMVs和BL-S均以浓度依赖的方式显著减弱炎症刺激下HaCaT细胞中的ROS产生。CMVs处理使ROS水平最大减少高达42.90%，在浓度≥ 2.5 μg/mL时观察到显著效果。类似地，BL-S强烈抑制ROS生成，最大抑制达到48.01%，并在浓度≥ 0.01 μg/mL时达到显著性。相比之下，BL-P对ROS水平没有显著的抑制效应。尽管CFS在中间浓度（6–7log CFU/mL）时引起了 modest 但显著的抑制（约10%），但更高浓度未能抑制ROS甚至轻微增加了其产生，表明 overall 效应有限。

本节中 cumulative evidence firmly establishes 了CMVs和BL-S在调节炎症角质形成细胞反应中的抗增殖和抗氧化功能，其中CMVs表现出更大的 overall efficacy。

2.5 Lp CMVs 和 BL-S 之间观察到不同的代谢物谱

为了揭示CMVs和BL-S效应相似性和差异性的潜在原因，我们进行了广泛靶向代谢组学分析，旨在研究各自的物质基础。

正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和聚类热图分析表明CMVs和BL-S之间的代谢物存在显著差异。详细的代谢物分析揭示了705种CMVs来源的代谢物和1001种BL-S来源的代谢物的存在，其中558种代谢物是CMVs和BL-S共有的。

CMVs的代谢物主要由多样的杂环化合物、激素和激素相关化合物、有机酸及其衍生物组成。值得注意的是，Anandamide（AEA）作为最丰富的有机酸衍生物出现，占该类别的80.67%，占总代谢组的17.24%。相比之下，BL-S的代谢景观以有机酸及其衍生物、氨基酸及其代谢物以及醇和胺为主。

为了进一步描绘CMVs和BL-S之间的差异代谢物，利用KEGG、HMDB和CHEBI数据库进行了代谢物溯源分析。该分析显示，与CMVs相比，BL-S表现出698种代谢物的显著上调和185种代谢物的显著下调。随后，对这些差异代谢物进行了KEGG通路分析。区分CMVs和BL-S的独特代谢物主要富集在ABC转运蛋白、甘油磷脂代谢、氨基酸生物合成和嘌呤代谢通路中。

总之，广泛靶向代谢组学揭示了CMVs和BL-S之间代谢物谱的显著差异，表明其功效的差异可能归因于这些差异。

2.6 富含于 Lp CMVs 中的 AEA 抑制细胞炎症、氧化和 M1 巨噬细胞极化

腐胺（Putrescine）和Anandamide（AEA）是两种在CMVs和BL-S之间浓度 exhibit significant differences 的主要代谢物。腐胺是一种广泛存在于生物体中的含氮脂肪族碱，属于多胺类。研究表明，来自共生细菌的腐胺在调节巨噬细胞平衡方面发挥作用，表现为增加抗炎巨噬细胞的比例和减少促炎巨噬细胞的比例。AEA是一种内源性、脂溶性的 cannabinoid，已被科学验证具有 plethora 生物活性，包括但不限于抗炎、镇痛、神经保护和抗焦虑作用。

CMVs中腐胺和AEA的含量分别是BL-S中的约15.68倍和13.90倍。鉴于这两种代谢物在CMVs和BL-S之间的浓度存在 substantial differences，我们评估了腐胺和AEA的抗炎、抗氧化和巨噬细胞极化调节作用，以确定CMVs中观察到功效的主要代谢物。

qPCR结果显示，腐胺和AEA都降低了发炎巨噬细胞内促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的mRNA表达。值得注意的是，与腐胺相比，AEA对巨噬细胞的炎症反应表现出更 potent 的抑制 impact。具体而言，在iBMDMs中，AEA显著降低TNF-α表达47.18%，IL-6表达76.60%，IL-1β表达38.37%，而腐胺显示对IL-6（31.15%）和IL-1β（46.95%）的 modest reduction，但对TNF-α没有显著影响（17.60%）。

在发炎角质形成细胞的背景下，腐胺未能表现出显著的抗炎效应，而AEA保持了其 pronounced 抗炎功效，显著降低TNF-α 63.91%和IL-1β 62.75%，尽管IL-6减少的趋势不显著（20.83%）。

类似地，流式细胞术显示，是AEA而不是腐胺显著抑制了LPS诱导的氧化应激并降低了巨噬细胞内的ROS水平。

随后，在骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的7天分化过程中，施用腐胺或AEA，并在最后一天给予LPS刺激。诱导完成后进行流式细胞术分析以评估巨噬细胞极化表型。结果表明，AEA显著且浓度依赖性地抑制巨噬细胞向M1表型极化。在25 μM时，AEA显著降低F4/80⁺CD80⁺和F4/80⁺CD86⁺细胞的比例，分别降低80.51%和73.96%。相比之下，腐胺仅表现出有限且不一致的效应：在10 μM时观察到F4/80⁺CD80⁺细胞的轻微减少（24.86%），而在该浓度下或在50 μM时，任一标志物均未检测到显著变化。

因此，很明显，AEA是负责CMVs中主要抗炎和抗氧化功能的关键代谢物，与其他生物活性分子协同作用以增强免疫抑制活性。此外，CMVs和BL-S之间观察到的功效差异也很可能归因于AEA的 significant contributions。

2.7 Lp CMVs 减轻了 IMQ 诱导的银屑病

在确认了CMVs的体外炎症和免疫调节功能后，有必要进行全面的体内研究以阐明其作用机制和潜在治疗应用。

使用咪喹莫特（IMQ）诱导银屑病样小鼠模型，并口服给予CMVs和BL-S进行治疗干预。治疗后，CMVs组的银屑病症状，包括皮肤厚度、红斑和鳞屑，表现出显著缓解，PASI显著降低。定量分析显示，与IMQ组相比，CMVs使厚度、红斑、鳞屑和总体PASI评分降低了约73-78%，与阳性对照（Dex组）的效果相匹配，两组治疗之间无显著差异。此外，BL-S组在这些参数上也显示出中度改善（减少52-63%），尽管其效果不如CMVs组 pronounced。

通过IMQ诱导银屑病模型后，与正常小鼠（Ctrl组）相比，小鼠的体重显著下降。然而，与IMQ组相比，治疗组之间的体重变化没有显著差异。

此外，皮肤组织的H&E染色分析显示，CMVs和BL-S治疗通过抑制表皮过度增殖显著降低了皮肤褶皱厚度。与IMQ组相比，CMVs给药使皮肤厚度减少56.11%。这种功效与阳性对照Dex相当，Dex使皮肤厚度减少66.42%。

免疫组化分析结果表明，CMVs和BL-S治疗都抑制了病变皮肤中F4/80⁺细胞的浸润，CMVs使F4/80⁺密度减少76.01%，这一结果再次与Dex相当（减少85.45%）。值得注意的是，只有CMVs和Dex促进了CD206⁺细胞的增加（分别为69.96%和86.46%），两组之间无显著差异。

qPCR分析显示，CMVs治疗后，皮肤炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的mRNA水平，以及M1/M2巨噬细胞表型标志物CD86/CD206，呈下降趋势。值得注意的是，CMVs使皮肤IL-1β显著减少96.07%。

同时，我们观察到CMVs、BL-S和Dex治疗后脾肿大的缓解，表明系统性炎症反应的减轻。特别是，CMVs使脾脏重量显著减少53.29%，与Dex实现的60.59%减少相当。正如预期的那样，对收获的小鼠脾脏的流式细胞术分析显示，CMVs治疗显著降低了脾脏CD11b⁺ F4/80⁺巨噬细胞（减少43.34%）和F4/80⁺ CD86⁺促炎巨噬细胞（减少34.63%）的比例。尽管有效，但CMVs对F4/80⁺ CD86⁺巨噬细胞的减少明显不如Dex实现的减少（59.19%） pronounced。

最后，我们评估了体内生物相容性。心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织学图像显示，所有组的组织结构和细胞形态均无显著改变，表明来源于植物乳杆菌的CMVs和BL-S具有生物相容性。

3 讨论

宿主-微生物相互作用在维持生理稳态中起着关键作用，肠道微生物组-免疫轴已成为慢性炎症性疾病的关键调节器。积累的证据表明，共生微生物组通过先天免疫 conditioning、屏障完整性维持和炎症级联调节来 orchestrate 免疫反应，这些作用由微生物代谢物如短链脂肪酸、次级胆汁酸、乳酸和细菌素介导。

值得注意的是，银屑病特征性的系统性炎症和免疫失调与微生物菌群失调密切相关。我们的数据分析揭示了在炎症性皮肤病中乳杆菌（一种典型的益生菌属）的显著耗竭。这种微生物失衡可能损害肠道屏障功能，促进细菌易位和随后的系统性免疫扰动， thereby underscoring 益生菌干预的治疗理论基础。

在本研究中，我们系统地研究了来源于Lp的生物活性成分的功能异质性，包括CMVs、BL-S、BL-P和CFS。CMVs和BL-S在体外均表现出显著的抗炎、抗氧化和抗增殖作用。然而，在CMVs和BL-S之间观察到功效的显著差异。CMVs显著抑制巨噬细胞向M1表型极化，而BL-S可能通过替代途径调节炎症，可能涉及炎症介质的非特异性调节或代谢重编程。

代谢组学分析将Anandamide（AEA），一种信号脂质衍生物，鉴定为在CMVs和BL-S中均富集的关键生物活性代谢物，并经过验证具有抗炎、抗氧化和巨噬细胞表型调节特性。然而，BL-S中AEA浓度显著低于CMVs，可能与BL-S相较于CMVs抗炎活性较低以及缺乏调节巨噬细胞极化的能力有关。然而，观察到的BL-S的中等抗炎和抗氧化效应可能不仅归因于其残留的AEA含量，还归因于其独特的代谢组学特征——特别是其丰富的功能性氨基酸，如L-脯氨酸（是CMVs的20.45倍）和L-赖氨酸（是CMVs的97.78倍）。研究报道，脯氨酸补充有助于缓解细胞炎症和ROS水平，作为清除剂保护细胞免受氧化损伤。类似地，赖氨酸及其聚合衍生物已被证明具有抗炎和抗氧化活性。这些发现表明，AEA和额外的代谢物都可能有助于BL-S的药理益处。

有趣的是，尽管腐胺（先前已被确定可调节肠道巨噬细胞平衡）的水平在CMVs中升高，但它对M1巨噬细胞抑制的贡献似乎可以忽略不计，表明其他协同成分的参与。

现有研究提供了关于AEA机制的潜在线索。作为内源性大麻素系统中天然存在的内源性配体，AEA在体内充当肠道微生物组和宿主代谢之间的中介。研究证明，肠道益生菌的抗炎作用至少部分是由内源性大麻素系统介导的，特别是通过AEA，它促进了肠道益生菌产生高水平的短链脂肪酸（如丁酸盐）来对抗炎症。此外，先前的研究已经确定，内源性大麻素信号增强肠道屏障完整性，并与微生物代谢物（如丁酸盐）协同发挥系统性抗炎作用。

在本研究中，与体外发现一致，CMVs在银屑病模型中表现出 superior 治疗功效，与BL-S相比，显著缓解银屑病炎症并减少促炎巨噬细胞浸润。这种功能优势可能源于CMVs独特的代谢组学特征，特别是AEA介导的内源性大麻素系统激活。

总之，基于这些发现，我们提出了一个“代谢组-免疫串扰”模型：来源于植物乳杆菌的四种生物活性成分，CMVs、BL-S、BL-P和CFS，表现出 distinct 功能作用，这可能与其多样的代谢物或其他成分组成有关。其中，富含AEA的植物乳杆菌源CMVs通过多维调节巨噬细胞极化、角质形成细胞过度增殖和氧化应激，在减轻银屑病发病机制方面 demonstrated the best therapeutic efficacy。这突出了菌株特异性微生物代谢物的治疗潜力，并强调了益生菌成分之间的功能异质性——即使在同一种内。鉴于这些发现，我们期待未来的研究更深入地探究AEA信号网络的具体机制和鉴定有助于BL-S抗炎作用的成分。将这些见解转化为临床应用将为管理像银屑病这样的慢性炎症性疾病提供新策略。

4 材料与方法

4.1 菌株

植物乳杆菌ATCC BAA-793从实验室的菌株库中获得。菌株在厌氧培养袋中的MRS肉汤培养基中培养。研究中使用的所有培养基、玻璃和塑料器皿在使用前至少在厌氧条件下暴露12小时。

4.2 细胞培养

THP-1细胞（人单核细胞系）购自美国模式培养物集存库（ATCC），在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的RPMI 1640培养基中培养，并通过50ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）诱导2天成为单核巨噬细胞。iBMDMs（永生化骨髓来源巨噬细胞）、RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞系）、HaCaT细胞（人角质形成细胞系）和L929细胞（小鼠成纤维细胞系）购自ATCC，并在补充有10% FBS和1% P/S的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养。所有细胞在37°C、5% CO₂气氛中生长。

4.3 BMDMs的提取

BMDMs从C57BL/6小鼠（6-8周龄）的股骨和胫骨中提取。骨骼用含有1% P/S的PBS清洗，然后用装有冰浴培养基的注射器冲洗以收集骨髓。收集的骨髓液离心以沉淀骨髓细胞，然后在冰上用适当体积的红细胞裂解缓冲液裂解2分钟，再次离心收集细胞。这些细胞随后在补充有10% FBS、1% P/S和30% L929细胞上清的RPMI 1640培养基中培养7天。

4.4 数据检索和微生物组分析

使用gutMDisorder在线数据库获取已发表的人类宏基因组测序数据PRJNA634145。该项目对15名健康受试者和33名银屑病患者进行了鸟枪法宏基因组分析。为了研究与银屑病相关的肠道微生物组，采用LEfSe分析和丰度统计来识别健康个体和银屑病患者之间的 distinct microbiota。在Disbiome在线数据库中进一步分析了四种炎症性皮肤病（特应性皮炎、痤疮、婴儿湿疹和银屑病）的细菌丰度变化，以确认炎症相关菌群。

4.5 文献计量学和可视化分析

Web of Science数据库作为搜索查询的专业数据源。如图所示，在Web of Science核心合集中，搜索限制在科学引文索引扩展版（SCI-EXPANDED），查询重点为“乳杆菌囊泡[主题]”、“乳杆菌裂解物[主题]”和“乳杆菌无细胞发酵上清[主题]”，分别获得202、205和157条引文。纳入标准设定为包括与细菌来源成分的治疗功能相关的文献。保留所有检索到的引文，然后分析文献中研究的细菌来源生物活性成分的治疗功能，并通过Origin进行热点细菌的可视化分析。

4.6 Lp生物活性成分的提取

植物乳杆菌在37°C厌氧条件下于MRS肉汤培养基中培养24小时。离心后，收集细菌沉淀和发酵上清。通过顺序真空过滤通过0.45 μm孔径膜过滤器（至少两次以确保完全去除大尺寸杂质），然后超速离心150,000 × g 90分钟，从细菌发酵上清中分离CMVs。通过0.22 μm无菌膜过滤器无菌过滤发酵上清获得CFS。用PBS洗涤细菌沉淀，进行高压匀浆以破碎细胞，然后收集细胞碎片和细菌裂解上清。称重后，将细胞碎片溶解在PBS中制备BL-P。将细菌裂解上清以1,000 × g 离心10分钟，3,000 × g 离心15分钟，和15,000 × g 离心30分钟以获得BL-S。所有生物活性成分在制备后应通过0.22 μm无菌膜过滤器无菌过滤，BL-S需通过0.8 μm、0.45 μm和0.22 μm膜梯度挤压至少10次。

4.7 Lp CMVs的表征

将Lp CMVs滴加到230目Formvar-碳覆铜网上，孵育10分钟。然后吸去多余液体并用PBS清洗铜网。随后，用2%醋酸铀酰染色铜网上的CMVs 1分钟，用蒸馏水清洗，并在暗处风干。使用透射电子显微镜（JEM-1400, 120 kV）获取