p16阴性/HPV阳性头颈部鳞状细胞癌中的CDKN2A缺失：揭示依赖p16免疫组化（IHC）作为HPV替代标记物的局限性背后的分子基础

本文揭示了p16免疫组化（IHC）作为HPV感染替代标记物在头颈部鳞癌（HNSCC）诊断中的关键局限性。通过四例p16阴性/HPV阳性（RNA ISH证实）的非角化型HNSCC病例，研究团队利用荧光原位杂交（FISH）技术证实其分子机制源于CDKN2A基因的纯合或杂合缺失。这一发现警示临床实践需结合形态学与直接HPV检测（如ISH或PCR），避免因单一依赖p16 IHC导致的诊断陷阱，对个体化治疗策略具有重要指导意义。

　　

引言：HPV与p16在头颈部鳞癌诊断中的角色演变

人乳头瘤病毒（HPV）相关口咽鳞状细胞癌（OPSCC）的发病率在过去30年中持续上升，目前占全球所有OPSCC病例的33%–71%。HPV16亚型约占所有HPV相关OPSCC的90%。准确确定OPSCC中的HPV状态至关重要，因为HPV阳性肿瘤对诱导化疗的反应率更高，对放疗的敏感性也更高。因此，HPV驱动的肿瘤可能需要降级治疗（de-escalated therapy），而与HPV无关的肿瘤则需要常规高强度的放化疗。此外，与HPV阴性OPSCC相比，HPV阳性OPSCC具有更好的总生存期和无进展生存期。

鉴定头颈部（HN）鳞癌（SCC）中HPV感染最常用的方法是p16免疫组化（IHC）。根据美国病理学家学院的定义，p16“阳性”是指至少70%的肿瘤细胞中存在至少中度至强度的核和胞质表达。总体而言，p16是一个可靠的替代标记物，在最近的荟萃分析中，其对HPV感染的敏感性和特异性分别为94%和83%。然而，p16与HPV之间存在不一致性，并且最近已被证明具有预后意义。因此，偶尔需要依赖更直接的检测方法，如HPV DNA PCR或HPV DNA/RNA原位杂交（ISH），以确保诊断的准确性。

材料与方法：多机构合作下的精准探索

通过多伦多西奈山医院、病童医院、渥太华医院、威斯康星大学医院和英属哥伦比亚大学之间的多机构合作，研究人员在存档病例中筛选出四例p16 IHC染色阴性但HPV RNA ISH呈阳性的非角化型鳞癌患者。对每位患者的医疗史、组织学特征和辅助检查进行了回顾性分析。

组织学和免疫组化方面，使用标准苏木精和伊红（H&E）染色对每个标本进行组织学审查。p16免疫组化使用多种经过验证的方案进行，包括Ventana Medical Systems的E6H4?克隆（手动或Ventana Discovery XT自动化平台）和Cell Marque的JC2克隆（在Dako Omnis平台上使用EnVision FLEX+检测系统）。

HPV基因分型检测针对病例1使用了加拿大国家微生物学实验室的Luminex检测（一种能够检测45种不同风险HPV基因型的多重PCR）。高危型HPV RNA ISH检测使用ACD RNAscope?高危探针鸡尾酒（探测18种转录活跃的高危HPV类型）在所有标本上进行。此外，所有标本还接受了荧光原位杂交（FISH）测试，使用针对CDKN2A（9p21.3，红色）和对照区域D9Z3（9q12，绿色）的双色位点特异性探针来评估CDKN2A缺失。

结果：揭示p16阴性/H PV阳性背后的分子机制

患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、主要干预措施、肿瘤分期、淋巴血管和神经侵犯状态、新辅助和辅助治疗状态、p16 IHC、HPV RNA ISH、CDKN2A FISH结果以及疾病复发状态均汇总于表中。

病例1为一名49岁男性，有饮酒史和少量吸烟史，表现为吞咽困难和有扁桃体肿块。影像学显示右侧扁桃体轻度不对称增大，伴有肿大、部分囊性和坏死的右IIA区淋巴结。活检显示主要为非角化型鳞状细胞癌。p16 IHC为阴性（0%染色）。鉴于形态学和临床特征，进行了HPV RNA ISH检测，结果为阳性。随后的FISH检测显示63%的细胞核中存在CDKN2A杂合性缺失。

病例2是一名38岁男性，有“喉疣状癌”史和大麻吸烟史，表现为喉部肿块。CO₂激光切除术显示为外生性非角化型乳头状鳞癌。p16 IHC为阴性。p53 IHC显示基底细胞保留，提示HPV相关染色模式。高危HPV RNA ISH呈阳性。CDKN2A FISH显示70%的细胞核中存在纯合性缺失。

病例3是一名79岁男性，下颌牙槽嵴有一个4.5 cm的肿块，接受了复合切除术和放疗。切除标本显示为疣状鳞癌，伴有广泛的原位癌成分，呈现HPV相关异型增生的外观。p16 IHC在浸润成分中仅显示极少量斑片状阳性染色（远低于70%阈值），但在原位成分中为块状阳性。HPV RNA ISH在浸润和原位成分中均为阳性。CDKN2A FISH显示纯合性缺失仅存在于浸润成分中，原位成分则显示正常的二倍体信号。该患者在初次切除后3个月出现局部复发。

病例4是一名73岁男性，扁桃体有一个1.5 cm的肿块，接受了扁桃体切除术。切除显示为非角化型鳞癌。p16 IHC为阴性。高危HPV RNA ISH呈阳性。CDKN2A FISH显示纯合性缺失。该患者术后168个月无复发证据。

对所有病例，研究者考虑了两种理论解释。第一种可能性是涉及一种罕见的HPV基因型，它不会以与典型高危HPV基因型相同的方式影响细胞周期，也不会导致补偿性的p16上调（科学文献中尚未描述此现象）。病例1通过HPV PCR检测基因型，结果检出的是典型的高危HPV16型，该亚型以诱导p16过表达而闻名，因此无法解释观察到的差异。第二种更可能的原因是CDKN2A突变、缺失或超甲基化，从而沉默该基因并影响p16蛋白的产生。病例1的肿瘤进行了下一代测序（NGS），未检测到CDKN2A突变，且存在CDKN2A转录本表达，强烈排除了纯合缺失或表观遗传沉默。最终通过FISH证实了杂合性缺失。同样，病例2-4通过CDKN2A FISH检测均显示纯合性缺失，解释了不一致的发现。

讨论：临床意义与未来考量

在缺乏p16染色的情况下出现HPV阳性是一个非典型发现，但通常不会被深入探究。一旦HN SCC中p16为阴性，诊断工作通常停止，肿瘤被推定为HPV无关，患者随后接受常规放化疗，而非考虑参与降级治疗试验。

本系列病例中，由于主要为非角化形态、其他HPV相关形态特征和/或提示HPV驱动肿瘤的临床表现，尽管p16 IHC均为阴性，仍通过HPV RNA ISH进行了直接HPV检测，且所有病例均为阳性。事实上，病例1、2和4中p16染色的完全缺失是可疑的，因为在传统的角化型鳞癌中，经常存在一些p16染色（未达到阳性判读阈值<70%，马赛克状）。

最终，我们病例中观察到的p16-HPV不一致的原因可归因于产生p16的基因CDKN2A的杂合或纯合缺失，这在HPV阳性OPSCC中是一种罕见发现。值得注意的是，在TCGA数据分析的36个HPV阳性HN SCC肿瘤中，仅两个（5.6%）存在CDKN2A杂合缺失，未发现纯合缺失、甲基化状态改变、点突变或剪接突变。相反，CDKN2A畸变是HPV阴性HN SCC中最常见的遗传学发现之一，54%–57%存在CDKN2A突变或基因丢失。据信，这可能部分解释了HPV阴性HNSCC中p16表达的广泛变异性和典型的阴性表现。此外，CDKN2A拷贝数丢失预示HPV阴性HN SCC的生存期更差，这可能与p16的相对缺失及其作为肿瘤抑制因子的作用有关。

最近一项对7654例口咽癌患者的多中心国际回顾发现，总体p16-HPV不一致率为9.2%，其中p16?/HPV+和p16+/HPV?的发生率分别为3.8%和5.4。其他研究也报道了类似的不一致率。有趣的是，这些研究还发现，总生存期和无病生存率因肿瘤是HPV相关还是p16-HPV不一致而异，最大的差异存在于p16-HPV同时双阳性和同时双阴性的癌之间。结合这些生存数据以及已知的HPV相关和HPV无关OPSCC对治疗敏感性的差异，正确诊断对于在试验环境中将患者恰当地分配至降级或常规放化疗至关重要。

本研究对p16免疫组化作为HPV感染替代标记物的效用提出了概念性思考。虽然p16染色与HPV状态普遍高度一致的主要原因是CDKN2A丢失在HPV驱动肿瘤中很罕见，但传统HN SCC中相对常见的CDKN2A缺失肯定也促成了这种效果。尽管HPV感染和CDKN2A缺失通常不同时发生，但我们已证明这两个过程并非互斥。在临床实践中，通过FISH、下一代测序、拷贝数分析检测到CDKN2A缺失，或p16免疫组化染色完全缺失，表明对HPV感染的评估无效，如果存在临床或形态学怀疑（如果最初进行了p16免疫组化，则很可能存在），则应采用更直接的方法。此外，人们不禁想知道，这些病例是否代表了HPV驱动HN SCC中一个不利的亚组，原因是附加了CDKN2A沉默的分子“打击”。

结论：诊断实践的启示与未来方向

总之，我们 presented四例p16阴性、HPV相关的头颈部鳞状细胞癌，其主要存在CDKN2A纯合缺失。在口咽和颈侧II–IV区，p16被用作HPV感染的替代标记物。在口咽之外，p16染色通常用作“排除”检测，当其为阳性时，是进行直接分子检测以确认HPV存在的指征。虽然在大多数情况下这种方法能得出正确诊断，但这些病例强调并解释了这种实践的局限性。通过我们的工作，我们确定了误导性IHC特征背后的分子基础，同时也突出了不同分子检测方法的优缺点。

未来，对于具有HPV感染临床和形态学特征但p16阴性，尤其是p16染色完全缺失的病例，应要求进行分子检测（通过ISH或PCR）以明确排除HPV感染。此外，必须认识到，正在进行下一代测序并检测到CDKN2A畸变的口咽、宫颈和肛门鳞状细胞癌病例，即使它们是HPV相关，p16染色也可能为阴性。随着对HPV相关癌症（包括口咽内和口咽外）认识的提高，完善诊断方案将为患者提供最量身定制和有效的治疗策略奠定基础。