孟加拉国首株IIIb基因型鸡贫血病毒的基因组与病理学特征及其进化意义

本文首次报道了孟加拉国IIIb基因型鸡贫血病毒（CAV）的完整基因组特征，通过临床病理学与分子生物学分析，揭示了VP1/VP2/VP3蛋白的关键突变及其对病毒抗原性、磷酸酶活性与凋亡诱导能力的影响，为CAV的进化研究与疫苗研发提供了重要依据。

　　

ABSTRACT

鸡贫血病毒（CAV）是一种高度传染性病原体，可引起家禽严重免疫抑制并造成重大经济损失，而孟加拉国有限的基因组数据阻碍了有效的疾病控制。本研究通过临床、病理学和分子分析（包括基因组测序、基因分型和病毒蛋白结构评估）对孟加拉国一次田间爆发的CAV毒株进行了表征。临床疑似表现出贫血、抑郁、鸡冠苍白和翅膀发绀的鸡只接受了大体和组织病理学检查。从骨髓样本中提取病毒DNA，使用PCR进行分析，然后通过新一代测序进行完整基因组测序。进行了病毒蛋白（VP1、VP2和VP3）的系统发育分析、基因分型、突变分析和结构预测，以评估进化关系和致病潜力。组织病理学证实了胸腺、脾脏和法氏囊中严重的淋巴细胞耗竭，这与CAV诱导的免疫抑制一致。分子检测确认十个样本中有八个存在CAV。全基因组分析揭示了一个2,330 bp、GC含量42%的基因组，聚类在IIIb基因型内，并显示出与中国毒株密切的遗传相关性。突变分析揭示了病毒基因组中的若干核苷酸替换，其中VP3蛋白中观察到的氨基酸变化数量最多。计算建模揭示了VP1和VP2的微小结构变异，这可能影响抗原性和磷酸酶活性。本研究提供了孟加拉国CAV毒株的完整基因组特征，揭示了可能影响病毒毒力的关键遗传变异。研究结果强调需要加强监测和有针对性的疫苗策略，以减轻家禽中CAV相关的损失。

IMPORTANCE

本研究首次提供了孟加拉国IIIb基因型鸡贫血病毒（CAV）毒株的完整基因组特征。通过整合临床、病理学和分子分析，该研究确定了可能影响病毒毒力、免疫逃逸和疾病严重程度的关键遗传变异。研究结果强调了该孟加拉国毒株与先前报道的中国毒株之间密切的遗传关系，暗示了潜在的流行病学联系。此外，该研究强调需要加强监测和有针对性的疫苗策略，以减轻家禽养殖中CAV诱导的免疫抑制和经济损失。从这项研究中获得的见解有助于更深入地了解CAV的进化，并可为未来保护家禽种群的诊断和控制措施提供信息。

INTRODUCTION

鸡传染性贫血由鸡贫血病毒（CAV）引起，对全球家禽业（包括孟加拉国）构成重大经济威胁。CAV主要感染2至4周龄的雏鸡，导致严重的病理变化，如贫血、出血综合征、蓝翅病、骨髓萎缩和胸腺萎缩。然而，其最关键的影响是免疫抑制，因为病毒侵入骨髓中的造血细胞和胸腺中的T淋巴母细胞。这导致更高的死亡率和对继发感染（包括新城疫、马立克氏病以及各种致病性细菌和真菌）的易感性增加。CAV可通过水平和垂直途径传播，其毒力取决于病毒毒株、剂量和传播途径等因素。虽然所有年龄的鸡都易感，但临床疾病主要出现在幼鸡（2-4周龄）。相比之下，年龄较大的鸡通常发生亚临床感染，临床症状轻微，但可作为病毒储存库。在易感幼鸡中，发病率和死亡率可高达80%和55%。

CAV是一种无包膜病毒，具有二十面体对称性，归类于Anelloviridae科Gyrovirus属。其基因组由一条单链闭合环状DNA组成，长度约为2.3 kb。基因组包含三个主要重叠的开放阅读框，编码三种病毒蛋白：一种结构蛋白（VP1）和两种非结构蛋白（VP2和VP3）。VP1是主要衣壳蛋白，对病毒复制、传播和毒力至关重要，因为它诱导宿主中和抗体。非结构蛋白VP2作为双特异性蛋白磷酸酶，并作为支架蛋白，确保病毒组装过程中VP1的正确构象。VP3，也称为凋亡素，在鸡胸腺细胞、T淋巴母细胞和髓样细胞中诱导凋亡。

CAV于1979年首次在日本发现，此后在全球传播。在孟加拉国，它于2002年首次在多个地区报告，但对流行毒株的研究仍然有限。由于其免疫抑制特性，CAV感染的鸡经常遭受继发感染、发育迟缓和饲料转化率差，给农民造成重大经济损失，并增加消费者成本。此外，由于制定有效预防策略的复杂性和治疗相关的高成本，控制CAV具有挑战性。了解流行CAV毒株的分子流行病学、进化模式和遗传变异性对于减轻该疾病的破坏性影响至关重要。这些知识可以促进疫苗开发和改进诊断方法。因此，在本研究中，我们通过临床症状、尸检发现和PCR鉴定了田间爆发的CAV。检查了脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、肺和心脏的组织病理学病变。对病毒完整基因组进行了测序，随后进行了主要病毒蛋白的系统发育分析、基因分型、突变检测和结构分析。

MATERIALS AND METHODS

样本采集

从孟加拉国中部Narsingdi地区一家经历急性爆发（发病率约10%，无记录死亡率）的商业肉鸡场收集了十只表现出CAV感染典型症状的鸡只，并运送到孟加拉国农业大学微生物学与卫生学系。受影响的鸡群为23日龄的Hubbard杂交肉鸡，源自父母代种鸡群。该农场采用全进全出系统，容量为2550只鸡，种鸡和肉鸡层面均未实施CAV疫苗接种计划。此外，收集了两只同龄健康鸡作为对照。解剖鸡只，收集肝脏、骨髓、脾脏、法氏囊、心脏、肺和胸腺样本，用于进一步实验，包括大体和显微镜检查以及病毒接种物制备。

接种物制备

收集每份骨髓样本五克，使用无菌剪刀和镊子精细切碎，并在研钵中使用研杵和无菌沙子进行匀浆。将匀浆悬浮在磷酸盐缓冲盐水中，制备10%（重量/体积）溶液。该悬浮液经过三次冻融循环以促进细胞破裂，随后以3,000 rpm离心两次，每次10分钟。收集上清液并用抗生素和抗真菌剂处理以防止污染。然后将处理过的样本用于DNA提取和随后的分子病毒检测。

大体和组织病理学检查

检查胸腺、脾脏、法氏囊、肺、肝脏和心脏的大体病理变化，并提交给孟加拉国农业大学外科与产科学系组织病理学实验室进行详细的组织病理学分析。每个组织样本被解剖，固定在10%福尔马林中，包埋在石蜡中，并使用标准组织学方案（包括苏木精和伊红染色）进行处理。在OLYMPUS CX41显微镜下检查染色切片，并在孟加拉国农业大学生理学系拍摄高分辨率显微照片，用于进一步评估和记录。

DNA提取和PCR扩增

使用TIANamp Virus DNA/RNA Kit（中国）从制备的接种物中提取DNA，遵循制造商的说明。提取的DNA立即用于PCR或在-20°C下储存备用。使用以下引物组扩增部分VP1基因：VP1-F: 5′-ATG GCA AGA CGA GCT CGC-3′ 和 VP1-R: 5′-TCA GGG CTG CGT CCC CCA-3′，产生1,350 bp的片段。PCR扩增在20 μL反应体系中进行，包含1.0 μL（终浓度500 nM）每种正向和反向引物、6 μL DNA模板、10 μL Master Mix（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）和2 μL双蒸水。反应条件如下：94°C初始变性5分钟；35个循环的94°C变性1分钟、59°C退火1分钟和72°C延伸1.5分钟；最后72°C延伸10分钟，随后在4°C保存。为了扩增部分VP2基因，使用引物组CAV-1 (5′-CTA AGA TCT GCA ACT GCG GA-3′) 和 CAV-2 (5′-CCT TGG AAG CGG ATA GTC AT-3′) 生成419 bp的DNA片段，遵循先前发布的方案。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶（用1×TBE缓冲液制备）上进行分离，并用溴化乙锭染色。在100 V电压下进行电泳120分钟，使用GelDoc Go系统（BioRad, USA）观察和分析扩增产物。

全基因组测序

使用新一代测序（NGS）技术（Illumina NovaSeq 6000）对完整的CAV病毒基因组进行测序。测序方法先前已有报道。简而言之，使用Rapid Plus DNA Lib Prep Kit for Illumina（Cat# RK20208）制备基因组DNA文库。对测序读数进行质量评估（FastQC v0.11.9）、接头和低质量碱基修剪（Trimmomatic v0.39）以及宿主DNA去除。将过滤后的读数与鸡贫血病毒分离株CAVDL21（NCBI登录号OQ749509.1）的参考基因组使用BWA进行比对。通过de novo组装（Unicycler）和Prokka（v1.14.6）注释实现环状基因组确认。最终组装显示约300倍覆盖率，并具有重叠末端，确认了环状结构。完整基因组被命名为CAV/Narsingdi-1-MGH-BD，已存入NCBI数据库。

系统发育树构建和基因分型

从GenBank使用NCBI BLAST检索了38个CAV毒株的全基因组序列。使用MEGA11软件对参考序列和CAV/Narsingdi-1-MGH-BD进行多序列比对。使用配对距离矩阵和邻接法构建系统发育树。在自举检验（1,000次重复）中，相关分类群聚集在一起的复制树的百分比标注在分支旁边，表示推断聚类的置信水平。按照先前发布的方案进行基因分型。从GenBank检索了各种CAV基因型的VP1基因完整编码区用于基因分型。

突变分析和蛋白质结构预测

从NCBI数据库检索参考序列（登录号NC_001427.1和AF395114.1）。使用CLC Sequence Viewer（版本8.0）将CAV/Narsingdi-1-MGH-BD的VP1、VP2和VP3基因序列中的核苷酸替换与检索到的参考序列进行比对。为了识别氨基酸替换，使用CLC Sequence Viewer将CAV/Narsingdi-1-MGH-BD的VP1、VP2和VP3的翻译序列与参考序列进行比对。使用Swiss-Model在线服务器预测VP1、VP2和VP3蛋白的三级结构，使用默认参数。将蛋白质序列提交到服务器，基于最高同一性和GMQE值构建模型。使用PyMOL软件可视化结构，并使用SAVESv6.0的Procheck工具和ProSA-web服务器分别通过分析Ramachandran图和Z-score进行验证。

RESULTS

临床、大体和组织病理学发现

受感染的鸡表现出典型的CAV感染临床症状，包括贫血、抑郁、鸡冠苍白和翅膀发蓝或发绀。根据农场记录本记录，鸡的发病率约为10%。大体病理学检查显示，与健康鸡相比，受感染雏鸡发生了显著变化。受感染雏鸡在皮下层、肺部出现出血，心脏有散在出血点。观察到法氏囊苍白且轻微萎缩。此外，受感染雏鸡表现出胸腺肥大，脾脏和肝脏颜色苍白、肿胀，而健康鸡没有此类病变。组织病理学检查显示脾脏、胸腺和法氏囊中存在大量淋巴细胞耗竭。观察到脾脏坏死、胸腺皮质变薄以及法氏囊滤泡萎缩和结构紊乱。注意到肝脏中肝细胞坏死和变性，以及心脏中心肌组织坏死和变性。肺部表现出严重充血和出血。

分子检测和全基因组测序

从疑似CAV感染和健康鸡的骨髓中提取的病毒DNA使用VP1和VP2基因特异性引物进行分析。凝胶电泳和随后的UV透射确认十个骨髓样本中有八个显示出目标特异性条带（分别为1,350 bp和419 bp）。正如预期的那样，在健康鸡的骨髓中未检测到病毒DNA条带。选择了一个PCR阳性样本（显示出指示高病毒载量的强VP1（1,350 bp）和VP2（419 bp）条带）进行全基因组测序（使用NGS）；对应的鸡表现出典型的CAV临床症状和严重的组织病理学病变。完整的CAV基因组为2,330 bp，GC含量为42%，包含三个编码区，编码VP1（1,350 bp）、VP2（651 bp）和VP3（366 bp），与文献中先前报道的完整CAV基因组（2,298–2,319 bp）一致。CAV分离株（CAV/Narsingdi-1-MGH-BD）的完整基因组序列已被分配GenBank登录号PQ412955、BioSample登录号SAMN44002588和SRA登录号PRJNA1167429。

系统发育分析和基因型表征

基于CAV/Narsingdi-1-MGH-BD的完整核苷酸序列与从GenBank检索的37个参考菌株的多序列比对构建了系统发育树。该树表明，鉴定出的CAV毒株与中国毒株（OQ749509.1）密切相关，并形成一个独立的簇。基于VP1基因序列的基因分型将CAV/Narsingdi-1-MGH-BD鉴定为IIIb基因型，聚类在CAV基因型IIIb组内。

CAV/Narsingdi-1-MGH-BD与参考菌株相比的突变分析

与NCBI参考菌株和BD-3（孟加拉国先前报道的唯一完整CAV基因组，于2004年鉴定）相比，对完整基因组进行了突变分析。在CAV/Narsingdi-1-MGH-BD的VP1、VP2和VP3基因中检测到各种同义和非同义核苷酸替换。对于VP1，鉴定出多个核苷酸替换，但与NCBI参考菌株（NC_001427.1）相比，这些都是同义突变，没有导致氨基酸变化。然而，与BD-3的比较揭示了九个导致氨基酸替换的非同义突变。对于VP2，鉴定出的核苷酸变异导致与参考菌株和BD-3相比存在单个非同义突变（A153V）。VP3显示出最高的非同义突变率，与NCBI参考菌株相比有五个氨基酸替换（E1V, P2A, T9M, F26L, K44E），而与BD-3相比仅观察到两个非同义变化（F26L和A38V）。

病毒蛋白的理化性质和预测三级结构

使用ProtParam程序表征病毒蛋白的理化性质，包括氨基酸数量、分子量（MW）、等电点（pI）、不稳定指数（II）、脂肪族指数（AI）和总平均亲水性（GRAVY）。研究结果表明，与参考序列相比，CAV/Narsingdi-1-MGH-BD的VP1、VP2和VP3蛋白存在轻微变异，但VP3表现出更高的稳定性。CAV/Narsingdi-1-MGH-BD与BD-3之间氨基酸序列的比较分析揭示了可能影响蛋白质功能的显著差异。与BD-3相比，VP1中的九个氨基酸替换改变了理化性质，BD-3显示出更高的AI（57.92 vs 54.31），表明热稳定性存在差异。VP2中的单个A153V突变尤其重要，因为缬氨酸替换引入了一个更疏水的残基，可能影响蛋白质的磷酸酶活性。对于VP3，与BD-3相比的两个突变（F26L和A38V）导致蛋白质稳定性的巨大差异，BD-3 VP3的II为145.4，而本毒株为42.68，表明本毒株的VP3明显更稳定。Ramachandran图分析显示，本毒株的VP3仅有66.90%的残基位于最有利区域，而BD-3为100%，表明可能影响凋亡素功能的构象差异。CAV/Narsingdi-1-MGH-BD中VP1、VP2和VP3蛋白的预测三级结构与参考菌株相比，由于氨基酸替换而显示出微小的结构差异。

DISCUSSION

CAV是一种影响家禽的重要病原体，主要靶向造血和免疫系统成分。本研究介绍了鉴定出的CAV毒株的临床、病理学和分子特征，包括完整基因组测序、基因分型和病毒蛋白结构分析。这些发现强调了孟加拉国家禽种群中病毒感染机制和CAV基因组进化。

CAV主要感染骨髓中的血细胞母细胞和胸腺中的前体T细胞，导致再生障碍性贫血和免疫抑制。贫血、抑郁、鸡冠苍白和翅膀发绀等临床症状表明由于病毒在骨髓细胞中复制导致严重的造血功能破坏。CAV通常在幼鸡中引起贫血和免疫抑制，其特征是苍白、淋巴器官（胸腺、脾脏和法氏囊）萎缩以及肝脏肿胀、斑驳。然而，在本研究中，非典型地观察到了肥大的苍白脾脏和胸腺。与其他病原体（如禽腺病毒）的并发感染可通过免疫抑制改变CAV的典型疾病进程。尽管CAV被归类为单一血清型，但基因分型在流行病学和临床上仍然具有重要意义，原因有几个。不同的基因型表现出不同程度的致病性；例如，即使在存在母源抗体的情况下，III基因型毒株也与更严重的临床疾病相关。一项中国研究进一步证明，在实验条件下，不同CAV毒株的死亡率可能存在显著差异。实验研究表明，III基因型CAV感染可导致受感染雏鸡的肝脏和脾脏肿胀、苍白。本研究中在CAV感染鸡中观察到的出血性肺和心脏表明可能存在并发感染，尽管未调查具体病原体。CAV毒株毒力的变异也可能导致不同的病理结果。我们的研究中鉴定出的IIIb基因型，在孟加拉国首次报道，并与先前描述的II基因型（BD-3）不同，这强调了评估当前疫苗毒株是否能针对流行野毒株提供最佳保护的必要性。尽管有疫苗可用，但孟加拉国报告的高血清阳性率表明，仅靠疫苗接种可能不足以有效控制CAV。我们检测到的具有独特突变（尤其是在稳定的VP3蛋白中）的IIIb基因型毒株，强调了将疫苗接种策略与严格的生物安全措施相结合的重要性。

组织病理学检查证实了胸腺、法氏囊和脾脏中显著的淋巴细胞耗竭，表明T细胞成熟受损和免疫能力降低。VP3蛋白，也称为凋亡素，在诱导造血前体细胞凋亡中起关键作用，导致红细胞生成减少和随后的贫血。凋亡素介导的凋亡是通过线粒体途径触发的，与细胞凋亡调节因子（如Bcl-2、caspase-9和caspase-3）相互作用。在脾脏和胸腺中观察到的组织病理学变化与凋亡介导的淋巴细胞耗竭一致，证实了CAV感染的免疫抑制性质。

在受感染鸡骨髓中病毒DNA的分子检测证实了CAV的造血嗜性。CAV/Narsingdi-1-MGH-BD的完整基因组测序揭示了2,330 bp的基因组长度，这与孟加拉国先前鉴定的BD-3毒株（2,298 bp）明显不同。2,330 bp的基因组大小落在完整CAV基因组的典型范围内（2,298–2,319 bp）。报道的CAV基因组大小的变异主要源于非编码调控区域的差异，特别是多聚腺苷酸化信号和VP1起始点之间的区域。尽管存在这些差异，CAV/Narsingdi-1-MGH-BD和BD-3都编码三种关键结构蛋白——VP1、VP2和VP3。系统发育分析表明，CAV/Narsingdi-1-MGH-BD与中国毒株（OQ749509.1）密切相关，并聚类在IIIb基因型内，而BD-3属于II基因型。这一发现暗示了孟加拉国和中国CAV毒株之间潜在的流行病学联系，可能由家禽贸易和流动促进。基因型分类进一步表明新的CAV毒株已传入孟加拉国，或者在过去二十年中病毒持续进化。

突变分析揭示了与NCBI参考菌株和孟加拉国先前唯一测序的CAV毒株BD-3相比，病毒基因中的若干同义和非同义核苷酸替换，以及病毒蛋白中的氨基酸变化。我们的毒株与BD-3之间VP1的九个氨基酸差异代表了孟加拉国CAV种群内显著的遗传分化。这些突变可能表明对当地条件的适应或不同毒株的传入。值得注意的是，与NCBI参考菌株相比，我们的毒株显示VP1没有氨基酸变化，而BD-3表现出多个差异，这表明就VP1序列而言，我们的毒株可能更接近祖先CAV谱系。此外，理化性质的计算分析表明，与参考菌株相比，CAV/Narsingdi-1-MGH-BD的VP1、VP2和VP3蛋白在MW、pI和亲水性方面表现出微小变异。我们的毒株（II 42.68）和BD-3（145.4）之间VP3稳定性的显著差异尤其值得注意。VP3（凋亡素）在诱导受感染细胞凋亡中起关键作用，在我们的毒株中观察到的更高稳定性可能有助于更有效地诱导凋亡，并可能具有更强的致病性。VP1、VP2和VP3的预测三级结构揭示了微小的构象差异，可能受氨基酸替换的影响。VP1的结构变异可能影响抗原性和免疫识别，而VP2的变化可能改变其磷酸酶活性，可能影响免疫调节。VP3突变可能增强凋亡效率，加剧受感染鸡的免疫抑制和疾病严重程度。

总之，本研究强调了孟加拉国新鉴定CAV毒株的临床、病理学和分子特征。研究结果证实，与先前报道的毒株相比，CAV/Narsingdi-1-MGH-BD表现出显著的遗传变异。系统发育分析确定了其与中国毒株的密切关系，将其归类为IIIb基因型。观察到的突变，特别是在VP3中，可能对病毒致病机制和免疫逃逸具有影响。需要进行大规模流行病学研究，并评估这些遗传变异对毒力和疫苗效力的功能影响。这些发现有助于更深入地了解CAV进化及其在家禽健康管理中的流行病学意义。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究由孟加拉国人民共和国政府大学教育资助委员会（UGC）（项目编号2024/18/UGC）资助。

M.G.H.构想了本研究。S.M.N.H.和N.J.收集了样本。M.A.和S.M.N.H.进行了实验室实验。M.A.和R.M.分析了数据，撰写了手稿初稿。R.M.、R.F.、F.A.和A.M.分析了蛋白质结构。S.A.和M.Z.R.进行了组织病理学检查。S.A.、S.S.、T.I.和M.G.H.审阅并编辑了手稿。所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。