合成苯并恶嗪二聚体衍生物ECD靶向c-Myc抑制结直肠癌进展

《Molecular Oncology》：A synthetic benzoxazine dimer derivative targets c-Myc to inhibit colorectal cancer progression

本文推荐了一种新型合成小分子ECD，其通过干扰c-Myc/MAX异源二聚体（c-Myc/MAX heterodimer）形成，诱导c-Myc蛋白泛素化降解（ubiquitin-mediated proteasomal degradation），并在体外（in vitro）、计算机模拟（in silico）及鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）体内模型（in vivo）中证实其能诱导DNA损伤（γ-H2AX焦点形成）、细胞周期G1期阻滞及凋亡（apoptosis，cleaved PARP↑），显著抑制结直肠癌（CRC）细胞肿瘤形成能力，为靶向“不可成药”癌蛋白c-Myc提供了新策略。

　　

1 引言

结直肠癌（CRC）是全球第二大公共卫生问题，其发病机制涉及癌蛋白激活与抑癌蛋白失活。c-Myc作为一种关键癌蛋白，在约70%的CRC病例中过表达，通过与MAX蛋白形成异源二聚体结合E-box（CACGTG）序列，调控细胞周期进程（如Cyclin D1、CDKs）。c-Myc蛋白稳定性受Ser62和Thr58磷酸化调控：Ser62磷酸化增强c-Myc/MAX二聚体活性并延长半衰期，而Thr58磷酸化促进其泛素化降解。目前直接靶向c-Myc的药物稀缺，因此开发小分子抑制剂具有重要临床意义。

苯并恶嗪二聚体衍生物通过曼尼希反应（Mannich reaction）和开环二聚化合成，其中EMD（N-甲基取代）已被报道可诱导c-Myc降解。本研究在此基础上合成结构修饰物ECD（N-环己基取代），旨在评估其通过靶向c-Myc/MAX复合物抑制CRC进展的潜力。

2 材料与方法

2.1 材料

实验使用CRC细胞系（HT29、HCT116、SW480、LoVo）及相应培养基、抗体（如c-Myc、PARP、γ-H2AX等）。ECD与EMD由泰国农业大学材料工程系提供。

2.2 二氢苯并恶嗪二聚体的合成

通过曼尼希反应（伯胺、多聚甲醛、酚类在二氧六环中回流6小时）合成苯并恶嗪单体，再与酚类无溶剂下60°C反应24小时进行开环二聚，得到包括ECD在内的8种衍生物（图1）。化合物结构经¹H NMR和¹³C NMR验证。

2.3 计算模型与分子对接

从PDB（ID: 1NKP）获取c-Myc/MAX晶体结构，使用AutoDock Vina将ECD对接到c-Myc/MAX界面结合口袋（网格中心坐标x=69.0, y=74.7, z=34.1）。ECD通过π-烷基、烷基相互作用与c-Myc（Arg914、Leu917等）及MAX（Arg215、Ile218等）残基结合，并通过π-阳离子相互作用与c-Myc的Arg913结合（图2A）。

2.4-2.15 细胞实验与分析方法

包括细胞培养、Western blot、免疫共沉淀（Co-IP）、细胞活力（结晶紫染色）、CAM移植瘤实验、流式细胞术（PI染色）、免疫细胞化学、蛋白质组学（LC-MS/MS）及生物信息学分析（如GO富集、STITCH数据库交互网络构建）。统计学处理采用单因素ANOVA或t检验。

3 结果

3.1 ECD通过计算模型预测其与c-Myc/MAX结合

分子对接显示ECD结合能（-6.002 kcal·mol^?1）优于EMD（-5.387 kcal·mol^?1），且与其他已知c-Myc抑制剂（如KJ-Pyr-9、MYCi975）相当（表1）。Co-IP证实ECD处理（75 μM）后HT29和HCT116细胞中c-Myc/MAX复合物丰度降低（图2B,C）。同时，ECD促进c-Myc Thr58磷酸化及泛素化修饰（MG132存在下polyubiquitin-c-Myc水平升高），表明其通过破坏二聚体诱导c-Myc降解（图2D）。

3.2 蛋白质组学揭示ECD引发DNA损伤

ECD对CRC细胞（除SW480外）呈浓度依赖性抑制活力，IC₅₀为50–75 μM（图5A,B）。蛋白质组学分析显示，ECD处理24小时后，HT29细胞中4114个蛋白质发生变化，其中114个为ECD特异性表达（图5C）。GO术语“细胞死亡”和“细胞周期”相关蛋白中，TOP2A（DNA拓扑异构酶2α）显著富集，RPA1（复制蛋白A1）下调，且MRNIP/MRE11A（DNA损伤修复复合物）及CYLD（去泛素化酶）表达上调（图5D-F）。这些变化提示ECD激活ATM介导的DNA损伤应答（DDR），并通过γ-H2AX焦点增加验证（附图S3）。

3.3 ECD诱导凋亡死亡并减少G1期细胞

Western blot显示ECD（48小时处理）显著升高cleaved PARP水平，而H3K9me3（衰老标志）无变化，表明凋亡为主要死亡方式（图6A-D）。流式细胞术证实sub-G1期细胞比例增加，且G1期细胞显著减少，G2/M期阻滞不明显（图6E,F）。细胞周期检查点蛋白p-Chk1和Cyclin B1在50–75 μM ECD时无显著变化，仅100 μM时轻微激活，而Cyclin D1持续下调（图6G,H），提示ECD通过抑制c-Myc下游通路破坏G1/S转换。

3.4 ECD抑制c-Myc表达并降低体内肿瘤形成能力

ECD处理48小时后，c-Myc蛋白水平在所有CRC细胞系中均下降（图7A-D）。CAM模型显示，经ECD预处理（50–75 μM）的HT29和HCT116细胞移植后，肿瘤形成率及体积显著降低（图7E-G）。免疫组化显示残留肿瘤中c-Myc表达虽未完全消失，但肿瘤形成能力明显受损（图7H-J）。Ki-67和Pan-CK染色进一步证实增殖抑制（附图S4），而p21在HT29细胞中胞质定位可能与其耐药性相关（附图S5）。

4 讨论

ECD作为N-环己基取代的苯并恶嗪二聚体，通过破坏c-Myc/MAX二聚化，促进c-Myc泛素化降解。其结合能优于N-甲基取代衍生物，且羟基等极性基团可增强靶点亲和力。蛋白质组学表明ECD通过上调TOP2A和下调RPA1引发DNA损伤（ATM通路），并调控CYLD/USP37影响c-Myc稳定性。c-Myc缺失导致Cyclin D1下调、G1期阻滞，并削弱PARP介导的DNA修复，最终诱导凋亡。CAM实验证实其体内抗肿瘤活性。

尽管c-Myc长期被视为“不可成药”靶点，ECD的结构可进一步优化（如片段化药物设计FBDD），以提高选择性并减少脱靶效应。与其他c-Myc抑制剂（如MYCi975、Mycro3）相比，ECD合成简便，为开发靶向c-Myc的临床候选药物提供了新方向。

5 结论

ECD通过干扰c-Myc/MAX二聚体形成，诱导c-Myc降解，进而引发DNA损伤、细胞周期紊乱和凋亡，在体外和体内模型中显著抑制CRC进展。其结构可塑性和明确的作用机制使其成为靶向c-Myc治疗的先导化合物。