大肠杆菌通过MtnR和CRP调控DHAP分流途径利用5′-脱氧核苷生长的机制研究

《Journal of Bacteriology》：Escherichia coli is poised to grow using 5′-deoxynucleosides via MtnR and CRP regulation of DHAP shunt gene expression

本研究揭示了肠道外致病性大肠杆菌中磷酸二羟丙酮分流途径的新型调控机制。该途径允许细菌在葡萄糖匮乏时，利用5′-脱氧核苷和5-脱氧戊糖作为替代碳源。研究发现，DHAP分流操纵子受碳分解代谢物阻遏和新型转录阻遏物MtnR的双重调控，确保其仅在底物存在且葡萄糖稀缺时充分表达。这项工作首次明确了该途径在细菌碳代谢层级中的地位，为理解病原菌在营养限制环境中的适应策略提供了新视角。

　　

摘要

磷酸二羟丙酮分流途径是多功能代谢通路，负责将5′-脱氧核苷和5-脱氧戊糖代谢为DHAP和醛类化合物。尽管前期研究证实携带该途径的大肠杆菌可利用外源MTA和5dAdo作为唯一碳源生长，但其调控机制尚不明确。本研究首次阐明，在大肠杆菌ATCC 25922中，DHAP分流基因与假定转运蛋白基因形成操纵子，受两个转录起始位点调控。远端低活性启动子呈组成型表达，而近端主要启动子受至少两种转录调节因子调控：新型阻遏蛋白MtnR在缺乏底物时抑制操纵子表达，cAMP受体蛋白在葡萄糖存在时实施碳分解代谢物阻遏。序列分析显示该调控模式在包括ST131谱系在内的多种致病菌中高度保守，证明DHAP分流是葡萄糖稀缺时利用5′-脱氧核苷的关键替代代谢途径。

引言

细菌生存依赖于对营养环境的动态适应。大肠杆菌通过多层级调控机制协调碳代谢，例如葡萄糖限制时通过Mlc阻遏蛋白和CRP调控磷酸转移酶系统基因表达。碳分解代谢物阻遏通过EIIA^Glc磷酸化状态调节cAMP水平，进而控制CRP对替代碳源代谢基因的激活。近期发现的DHAP分流途径使大肠杆菌能够以MTA、5dAdo及其衍生物作为唯一碳源。在ExPEC菌株中，该途径基因位于tRNA-leuX基因组岛，其上游存在高度保守的799 bp非编码区。与其它微生物中DHAP分流的硫源利用功能不同，大肠杆菌中该途径主要参与碳代谢，但其调控机制尚未解析。

材料与方法

以天然携带DHAP分流基因的ATCC 25922为研究对象，通过λ-red重组系统构建crp和mtnR缺失株。利用启动子-lacZ融合载体进行转录活性分析，通过引物延伸法鉴定转录起始位点。采用RNA-seq技术比较葡萄糖与5dR生长条件下的转录组差异，并通过qRT-PCR验证关键结果。通过电泳迁移率变动实验验证CRP与启动子区的结合特性，利用生物信息学工具分析启动子保守性。

结果

转录组分析揭示DHAP分流基因受底物特异性调控

比较5dR与葡萄糖生长条件下的转录谱发现，392个基因表达差异显著。DHAP分流基因表达上调达7.5 log₂倍，且与相邻转运蛋白基因呈现协同表达模式，提示其构成操纵子。碳饥饿实验表明，该途径诱导程度远低于典型饥饿应答基因，且不伴随应激蛋白表达升高，证明其调控具有底物特异性而非普遍应激反应。

启动子结构解析发现双启动子系统

序列保守性分析显示，DHAP分流操纵子上游799 bp区域在1569个菌株中高度保守。启动子定位实验表明，主要调控元件位于mtnK起始密码子上游66-126 bp区域。鉴定出两个转录起始位点：近端主要启动子P1位于mtnK上游72 bp处，具有典型-10和-35元件；远端启动子P2位于上游188 bp处，活性较低且缺乏明显调控。LacZ报告系统证实P1受碳源调控，而P2活性仅为前者的1/50。

MtnR新型阻遏蛋白的功能验证

位于操纵子对侧的yjhU基因编码DeoR家族转录调节因子，被命名为MtnR。缺失mtnR使DHAP分流基因在葡萄糖条件下表达上调5 log₂倍，回补实验可恢复抑制表型。该蛋白特异性作用于P1启动子，其结合位点可能覆盖-10元件区域的半回文序列。值得注意的是，mtnR广泛存在于大肠杆菌基因组中，其缺失同时影响铁转运蛋白efeU表达，提示该调节因子可能具有多靶点调控功能。

CRP介导的碳分解代谢物阻遏机制

crp缺失株完全丧失5dR利用能力，但不影响葡萄糖生长。双碳源培养呈现典型二次生长现象，证明该途径受碳源优先级调控。生物信息学预测发现P1启动子-35.5位置存在CRP结合位点，EMSA实验证实CRP-cAMP复合物可特异性结合该区域。启动子活性分析显示，葡萄糖存在时即使添加5dR也仅能诱导2倍表达，说明CRP介导的阻遏占主导地位。

讨论

本研究首次系统阐述大肠杆菌DHAP分流途径的调控网络。该操纵子采用双启动子设计：P1受CRP和MtnR精细调控，构成class II型CRP依赖型启动子；P2可能维持基础表达水平。MtnR作为DeoR家族新成员，可能通过感知5-脱氧核糖-1-磷酸等途径中间产物解除抑制。这种双锁机制确保细菌仅在葡萄糖匮乏且存在特定底物时启动该途径。

从进化视角看，DHAP分流基因主要存在于ExPEC菌株，而mtnR在各类大肠杆菌中保守分布，提示该调控系统可能源于古老的压力应答网络改造。在尿液等葡萄糖浓度低于250 μM的感染环境中，宿主细胞代谢产生的MTA和5dAdo可达100 μM浓度，该途径可能为病原菌提供竞争优势。未来研究需明确MtnR的效应分子及其与铁代谢等通路的交叉调控关系。

结论

DHAP分流途径是ExPEC碳代谢网络的重要组成部分，其通过CRP和MtnR的双重调控实现表达精准控制。该研究不仅揭示了一种新的细菌适应性策略，也为针对病原菌代谢弱点的抗菌治疗提供了潜在靶点。对保守调控元件的解析表明，这一代谢适应性机制在进化上具有重要价值。