格氏假单胞菌SRIHER B649全基因组测序及鼠李糖脂合成基因rhlAB的首次定位研究

《Microbiology Resource Announcements》：Whole genome sequence of rhamnolipid synthesizing Pseudomonas guguanensis strain SRIHER B649

本研究报告首次完成了格氏假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）SRIHER B649菌株的全基因组测序（WGS），成功定位了负责合成高分子量鼠李糖脂的关键基因簇rhlAB。该研究为利用基因工程手段优化这种高效生物乳化剂的生产奠定了分子基础，对生物修复和工业生物技术领域具有重要意义。

　　

ABSTRACT

Pseudomonas guguanensisstrain SRIHER-B649 was isolated in the oil-contaminated waters of Chennai harbor, India. Whole genome sequencing was performed for the first time to determine the location and size of the rhamnolipid synthesizing rhlABgene. Genetic engineering experiments can undoubtedly benefit from the collected data for this strain.

ANNOUNCEMENT

从印度金奈港的石油污染水域中分离得到一株格氏假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）SRIHER-B649。该菌株能在富含2.5%十六烷的Bushnell-Haas培养基中良好生长，并产生一种高分子量的单鼠李糖脂（分子量为1,264.52 Da），其对十六烷的乳化率高达56%，相关技术已获得印度专利授权（548405）。为了对该菌株进行鉴定，研究人员提取了其DNA，扩增并测序了16S rRNA基因。测序结果与GenBank数据库进行比对后，确认该菌株为格氏假单胞菌（GenBank登录号KU302611.1），这一结果也在印度微生物技术研究所（IMTECH）得到了进一步确认。尽管该菌种最初发现于台湾龟山岛，但关于其具有烃类降解能力的报道尚属首次。

已知鼠李糖基转移酶基因（rhlAB）参与了这种高分子量乳化剂的生物合成。为了精确定位和识别该基因，需要进行全基因组测序，因为此前仅有该菌株的基因 scaffold 信息可供参考。因此，研究人员从培养的格氏假单胞菌中提取基因组DNA，并对标准CTAB法进行了优化：不使用β-巯基乙醇；在95°C孵育1小时而非65°C孵育30分钟；使用氯仿而非氯仿-异戊醇混合物；并在氯仿孵育的初始步骤加入RNase A。随后，使用Nextera DNA Flex Library Prep Kit进行DNA片段化和文库构建。构建好的文库经过连接双索引接头和纯化后，使用Agilent 2200 TapeStation系统和Qubit dsDNA HS检测试剂盒分别评估文库的质量和浓度。合格的高质量文库在浦那国家微生物资源中心使用Illumina MiSeq平台（2 × 250 bp测序化学）进行测序。最终获得967,586条原始读长（raw reads），读长为250 bp。使用FastQC Toolkit v0.11.8进行原始数据质量评估，并使用NGS QC Toolkit v2.3.3去除低质量数据。基因组组装使用SPAdes 3.11.1组装器完成。组装后的基因组包含60个scaffold，N50值为314,320 bp，基因组大小为5,560,392 bp，覆盖度为120倍。最后，使用NCBI原核基因组注释管道（PGAP, v.6.8）对公开的基因组进行注释，预测到5,121个编码基因。

基于全基因组测序数据，研究人员成功鉴定出推定的rhlA基因。格氏假单胞菌的rhlA基因与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1菌株（NC_002516.2）的rhlA基因同源性为72.2%，与格氏假单胞菌JCM 18416菌株（NZ_FNJJ01000001.1）的 scaffold 序列同源性高达98.5%。通过与铜绿假单胞菌的rhl基因布局进行比对，研究人员解析了格氏假单胞菌中rhlAB基因的推定排列方式：一个500 bp的启动子区，一个888 bp的推定的rhlA基因（与WGS数据一致），一段64 bp的短序列，以及一个1,300 bp的推定的rhlB基因。为了确保编码序列的完整性，在目标基因两侧还包含了一些核苷酸序列，因此格氏假单胞菌rhlAB基因的总序列长度为2,752 bp。这是首次在格氏假单胞菌中鉴定出rhlAB基因的位点和序列，该发现将为从事该菌株鼠李糖基转移酶研究的人员提供重要信息。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究得到了印度地球科学部（MoES/36/OOIS/Extra/50/2016）以及SRIHER博士奖学金（Founder-Chancellor Shri N.P.V. Ramasamy Udayar Research Fellowship 2019, Ref No: Founder-Chancellor Fellowship- 2019-20-6）的资助。

DATA AVAILABILITY

格氏假单胞菌SRIHER B649菌株的全基因组鸟枪法测序序列已存入GenBank，BioProject编号为PRJNA1014258，BioSample编号为SAMN37322556，登录号为NZ_JAVKYQ000000000，版本号为NZ_JAVKYQ000000000.1。原始测序读长可在NCBI SRA数据库中找到，编号为SRR34789558。格氏假单胞菌SRIHER B649菌株的rhlA基因序列也已存入GenBank，登录号为PX069939.1。