基于DAN13aa荧光传感器定量揭示KRas突变细胞中PI(4,5)P2膜脂异质性及其对信号转导的影响

《Journal of Biological Chemistry》：Detection of PIP 2 distributions in biological membranes using a peptide-based sensor

本研究针对如何精确量化活细胞质膜上关键信号脂质PI(4,5)P2的密度与空间分布这一难题，开发并优化了基于DAN13aa肽的荧光传感器结合堆叠支撑脂质双层的定量平台。研究证实该传感器能线性响应PI(4,5)P2浓度变化，并成功应用于检测不同KRas突变细胞中PI(4,5)P2的稳态水平与异质性。结果表明，致癌性KRas突变导致PI(4,5)P2膜分布发生特异性改变，且G12C抑制剂Sotorasib能快速逆转此异常。该研究为理解脂质介导的致癌信号转导提供了新视角。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，质膜不仅是一道物理屏障，更是一个动态的信号枢纽。其中，磷酸肌醇脂质，特别是磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P₂），扮演着至关重要的角色。它如同细胞膜上的“信号货币”，参与调控众多关键的细胞过程，包括细胞骨架重组、膜运输、离子通道活性以及由受体酪氨酸激酶（RTK）和小G蛋白Ras所驱动的信号通路。Ras蛋白的突变是许多癌症的驱动因素，其异常激活会通过下游效应物如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）影响磷酸肌醇的代谢，将PI(4,5)P₂转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PI(3,4,5)P₃），从而强烈促进细胞增殖与存活。

尽管PI(4,5)P₂的重要性毋庸置疑，但科学界长期以来面临一个技术瓶颈：如何在活细胞中精确、无创地量化其在中性膜环境下的真实密度和空间分布。传统的检测方法，如利用PLCδ1的PH结构域，往往因其高亲和力、可能干扰内源性相互作用以及表达水平不均一等因素而受限。因此，开发一种能够快速、定量反映PI(4,5)P₂动态变化的新型工具，对于深入理解其在生理和病理条件下的功能，尤其是在Ras驱动癌变过程中的具体作用，具有迫切的科学意义。

为了回答这一挑战，发表在《Journal of Biological Chemistry》上的这项研究，采用了一种创新的策略。研究人员利用一种名为DAN13aa的肽基荧光生物传感器，该传感器包含一个对局部环境敏感的荧光团2-二甲氨基-6-酰基萘（DAN）和一个能结合PI(4,5)P₂的阳离子十三肽。当传感器结合PI(4,5)P₂进入疏水环境时，其荧光发射峰会从520纳米（绿色，未结合态）蓝移至450纳米（蓝色，结合态），从而实现比率型检测，其信号比值（I₄₅₀/I₅₂₀）与PI(4,5)P₂密度成正比。本研究的关键创新在于建立了一个高度优化的体外校准平台——堆叠支撑脂质双层（SSLB），有效解决了传感器非特异性结合的问题，并验证了其在生理相关浓度范围内的线性响应和快速结合动力学。随后，研究者将此校准后的传感器应用于一组等基因的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），这些细胞仅表达野生型或特定的致癌KRas4B突变体（G12C, G12D, G12V, G13D），为在纯净的遗传背景下研究Ras突变对PI(4,5)P₂的影响提供了理想模型。

研究团队主要运用了以下几项关键技术：1）构建堆叠支撑脂质双层（SSLB）模型用于生物传感器的精确校准；2）全内反射荧光（TIRF）显微镜进行高信噪比的细胞膜表面比率成像；3）灰度共生矩阵（GLCM）纹理分析算法量化PI(4,5)P₂在细胞膜表面的空间分布异质性；4）使用KRas G12C特异性抑制剂Sotorasib进行药理学干预，评估其对PI(4,5)P₂表型的逆转效应。研究所用的MEF细胞系为实验室构建的等基因细胞模型。

SSLBs Enable Precise Calibration of the DAN13aa PI(4,5)P2 Biosensor

研究人员首先致力于解决DAN13aa传感器的定量校准问题。他们发现，在传统的单层支撑脂质双层（SLB）上，带正电的传感器会穿透脂双层非特异性结合到带负电的玻璃基底上，背景信号很高。为此，他们开发了堆叠支撑脂质双层（SSLB）系统：先在多聚赖氨酸包被的玻片上形成一层不含PI(4,5)P₂的底层脂双层（99% DOPC/1% DOPS），其上再覆盖一层多聚赖氨酸，最后形成含有不同比例PI(4,5)P₂（0%-10%）的顶层脂双层。这种结构有效屏蔽了传感器与基底的相互作用，显著降低了背景。荧光恢复 after 光漂白（FRAP）和单分子追踪实验证实了SSLBs中脂质的流动性。利用此平台，研究人员证实DAN13aa传感器的比率信号与顶层脂双层中PI(4,5)P₂的摩尔百分比在0%到10%范围内呈现优异的线性关系（R2 = 0.964）。同时，传感器表现出快速的结合/解离动力学，冲洗后信号迅速消失，表明其对内源性PI(4,5)P₂相关过程的扰动较小。选择性测试显示，DAN13aa对PI(4,5)P₂的敏感性约为对PI(3,4,5)P₃、PI(4)P或磷脂酰丝氨酸（PS）的2-3倍，具有一定的特异性。

Application of the DAN13aa Sensor to Steady state PI(4,5)P2 Levels and Distributions in Living Cells

将校准后的传感器应用于表达野生型KRas4B的MEF细胞，流式细胞术显示传感器能被细胞快速、均匀地摄取。TIRF显微镜下的比率成像揭示了细胞基底膜表面PI(4,5)P₂的分布情况。经SSLBs校准曲线换算，细胞膜表面PI(4,5)P₂的局部浓度可达近1 mol%，并观察到明显的聚集现象，这与既往研究认为PI(4,5)P₂在膜上存在簇集的观点一致。与常用的PLCδ1 PH结构域传感器对比发现，DAN13aa检测到的信号在细胞间变异较小，可能反映了其更低的亲和力以及更少的内源性竞争干扰。

Steady state PI(4,5)P2 Densities in MEFs Expressing Ras Mutants

研究的核心发现来自于对不同KRas基因型MEF细胞的比较分析。令人惊讶的是，在稳态条件下，与野生型细胞相比，表达致癌突变KRas（G12C, G12D, G12V, G13D）的细胞不仅平均PI(4,5)P₂水平发生变化，其空间分布的异质性也显著增加。通过GLCM纹理分析提取的“对比度”参数来量化空间异质性，研究者发现不同的Ras突变体在“平均密度-空间异质性”二维图上呈现出独特的“指纹”特征：G13D突变细胞具有最高的PI(4,5)P₂水平和最强的异质性；野生型细胞则具有最低的水平和最均匀的分布；G12D和G12V突变细胞平均水平相近，但后者异质性稍高。这表明不同的Ras突变通过特定机制差异性地影响了质膜PI(4,5)P₂的组成。

Treatment of MEF cells expressing the KRas4B G12C Ras mutant with Sotorasib leads to a PIP2 surface abundance and distribution that resembles the WT KRas4B protein

为了探究靶向干预能否逆转致癌Ras引起的PI(4,5)P₂异常，研究人员用KRas G12C特异性共价抑制剂Sotorasib处理G12C突变细胞。显著的是，仅用药1小时后，G12C细胞的PI(4,5)P₂水平和空间分布异质性就迅速向野生型表型回归。这一结果不仅证明了Sotorasib的有效性，也提示细胞膜脂质组成作为Ras信号通路活性的一个敏感且快速响应的读数，可能具有药效学生物标志物的潜力。

综上所述，本研究通过巧妙结合DAN13aa荧光生物传感器与堆叠支撑脂质双层校准系统，成功建立了一种定量可视化活细胞质膜PI(4,5)P₂的新方法。应用该方法，研究首次揭示致癌性KRas突变并非简单地一致降低PI(4,5)P₂水平（如单纯通过PI3K转化所预期），而是导致其产生突变特异性的密度变化和空间分布异质性增加。这种膜脂质景观的重塑可能是Ras驱动癌变的一个重要且以往被忽视的特征。更重要的是，KRas抑制剂Sotorasib能快速逆转G12C突变细胞的PI(4,5)P₂异常分布，表明膜脂质组成可作为监测靶向治疗响应的潜在指标。该研究不仅为理解磷酸肌醇脂质在细胞信号转导中的精细调控提供了新的技术手段和深刻见解，也为探索针对脂质代谢异常的癌症治疗新策略开辟了新的方向。论文所展示的膜脂质“指纹”概念，未来或可应用于癌症分型、药物筛选和疗效评估等多个生物医学领域。