模拟微重力下铜绿假单胞菌生物膜形成的时序性转录组与代谢组整合分析揭示lasI介导的群体感应调控机制

《Current Research in Microbial Sciences》：Simulated Microgravity Induces Time-Dependent Enhancement of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Formation

本研究针对长期太空飞行中机会性病原体铜绿假单胞菌(PAO1)生物膜形成增强带来的健康风险，通过30天模拟微gravity(SMG)暴露，结合转录组学、代谢组学和多组学整合分析，系统揭示了SMG通过激活群体感应(QS)系统(特别是lasI/lasR通路)及重编程中心碳代谢(如TCA循环、ABC转运体)，时间依赖性地上调生物膜形成的关键分子网络。该发现发表于《Current Research in Microbial Sciences》，为空间微生物适应性进化及航天感染防控提供了新靶点。

　　

随着载人航天事业向深空探索迈进，宇航员在长期太空任务中面临的健康风险日益凸显。其中，机会性病原微生物在太空特殊环境下的适应性进化及其引发的感染问题，已成为空间生命科学领域的重要挑战。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为一种常见的条件致病菌，以其强大的环境适应能力、内在耐药性以及卓越的生物膜形成能力而闻名。在地面环境中，该菌是医院内感染的重要病原体，尤其易在囊性纤维化患者肺部形成难以清除的生物膜，导致慢性感染。太空微重力环境是否会改变此类病原菌的致病特性，进而威胁宇航员健康，是亟待解答的关键科学问题。

已有研究表明，短期微重力暴露（如数天）能显著增强铜绿假单胞菌生物膜的厚度和活菌数。然而，关于长期模拟微gravity(SMG)如何影响其生物膜发育动态及其背后的分子机制，目前认知仍存在空白甚至矛盾之处。例如，有研究发现延长低剪切模拟微gravity(LSMMG)暴露反而会抑制特定菌株的生物膜形成。这种时间依赖性的表型差异提示，微生物对微重力的适应是一个复杂的动态过程，需要从系统生物学层面进行深入解析。为此，研究人员在《Current Research in Microbial Sciences》上发表了最新研究成果，通过为期30天的模拟微重力培养，综合运用生理表型分析、转录组学、代谢组学以及基因敲除验证等技术，系统阐述了铜绿假单胞菌PAO1在长期SMG下生物膜形成的时序性规律及其核心调控网络。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：利用Gravite?模拟微重力设备进行长期（15、30、45、60天）细菌培养；通过结晶紫染色法定量生物膜生物量，并结合扫描电子显微镜(SEM)观察其超微结构；采用RNA测序(RNA-seq)进行全基因组转录组分析，鉴定差异表达基因(DEGs)；利用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)进行非靶向代谢组学分析，鉴定差异积累代谢物(DAMs)；通过多组学整合分析（如KEGG通路富集、基因-代谢物相关性网络构建）揭示协同调控通路；采用实时荧光定量PCR(qPCR)验证关键基因表达；并利用CRISPR-B?基因编辑技术构建lasI基因敲除突变体进行功能验证。

生理特性揭示SMG下生物膜形成的时序性增强

研究人员首先监测了铜绿假单胞菌PAO1在SMG下的生长曲线，发现与正常重力(NG)对照组相比，SMG处理30天(SMG30)的菌株表现出更高的生长速率。更重要的是，生物膜定量分析显示，SMG对生物膜形成的影响具有明显的时间依赖性。暴露15天(SMG15)时，生物膜生物量反而低于NG15对照组；然而，从30天开始，SMG30组的生物膜生物量显著超越NG30对照组，并且这种增强效应在45天和60天时持续存在。扫描电镜结果直观地印证了这一趋势：SMG15菌株细胞分布稀疏，缺乏结构化生物膜；而SMG30则诱导了细胞密度的显著增加和包裹在胞外基质中的致密生物膜形成。这表明30天是SMG诱导铜绿假单胞菌生物膜结构成熟的关键时间节点。

转录组谱揭示SMG下的适应性调控机制

通过对SMG30与NG30条件下的菌株进行转录组测序，研究人员发现共有5468个基因存在差异表达，其中519个基因上调，25个基因下调。上调基因中包含了与生物膜合成和群体感应调控相关的关键基因，如himD（编码整合宿主因子β亚基）、arcA（精氨酸脱亚胺酶途径关键酶）、aceE和aceF（丙酮酸脱氢酶复合体核心组分）以及rhlR（群体感应调控因子）。这些基因的协同上调与观察到的生物膜增强表型相符。KEGG通路富集分析进一步揭示了SMG下的多重适应性调整：包括胰岛素抵抗信号通路的调制、III型分泌系统效应蛋白（如exoS, exoY）的上调、二甲苯降解途径组件（如xylXYZ, BenABC）的表达增强，以及生物膜形成调控因子（如pel, pqs, rhl系统）和粘附因子（如pilA, fliC）的协同激活。这些转录变化展示了细菌为适应微重力而进行的全面代谢重编程。

代谢组学分析揭示支持SMG适应的代谢重构

代谢组学分析显示，SMG30菌株与NG30菌株共享1145种核心代谢物，但SMG30特有15种独特代谢物。火山图分析鉴定出1007种差异代谢物，其中149种上调，10种下调。显著上调的代谢物包括2-氨基庚二酸、丙氨酸、甜菜碱、柠檬酸盐等。箱线图分析进一步证实，甜菜碱、泛酸等关键代谢物在SMG30下浓度显著高于NG组。KEGG富集分析表明，差异代谢物显著富集于赖氨酸生物合成、β-丙氨酸代谢、泛酸/辅酶A生物合成、氨基酸代谢途径、ATP结合盒(ABC)转运体以及氧化磷酸化等通路。这些协调的代谢转变表明，细菌通过中心代谢途径的重构为微重力环境下的生存提供能量和物质支持。

整合分析揭示SMG适应的调控网络

整合转录组与代谢组数据的弦图显示，在SMG下，代谢物（如乙酰胆碱、2-羟基肉桂酸、吲哚啉等）与转录因子（如PA3720, PA4600）之间形成了密集的调控网络。联合通路富集分析揭示了苯甲酸降解、β-内酰胺抗生素耐药性、ABC转运体活性、赖氨酸降解、三羧酸(TCA)循环等多个通路的共同富集。这些结果表明，SMG诱导了从碳源代谢、应激耐受到耐药性形成的多维度适应性响应。

时序转录组比较凸显SMG30的特异性调控

比较SMG15与SMG30的转录组发现，SMG30特异性表达35个差异基因。SMG30菌株显著上调了PA5227、hupB/himD、PelA（多糖合成酶）和rsaL（群体感应调控因子）等基因。这些基因分别通过调控DNA拓扑结构、胞外基质组装和群体感应信号分子合成，共同驱动生物膜从粘附到成熟的进程。KEGG富集分析显示，SMG30菌株通过激活轴突再生（与菌毛/鞭毛组装相关）、磷脂酶D信号（膜磷脂代谢）和氨基糖苷类生物合成（耐药酶表达）等通路，形成了多维度的适应性网络。

lasI介导的群体感应通路是SMG增强生物膜形成的关键

基于转录组学提示群体感应系统可能发挥核心作用，研究人员通过qPCR验证了生物膜相关基因的表达。结果显示，与NG对照相比，SMG15显著上调了lecA（粘附）、lasB（基质蛋白酶）和lasI（群体感应）基因；而SMG30进一步上调了包括lecA、lecB、lasA、lasB、lasR在内的12个基因。时序分析表明，延长SMG暴露增强了lasA、lasI和rhlB（鼠李糖脂合成）的表达。最关键的是，构建lasI基因（负责合成AHL群体感应信号分子）敲除突变体后，发现在SMG条件下，突变体的生物膜形成能力相较于野生型显著受损。这直接证实了SMG主要通过激活lasI介导的AHL信号通路来增强铜绿假单胞菌的生物膜形成。

本研究通过多组学整合分析，系统阐明了铜绿假单胞菌PAO1在长期模拟微重力环境下通过协调群体感应、毒力表达和代谢重编程，时间依赖性地上调生物膜形成的分子调控网络。该网络不仅直接激活生物膜结构基因，还通过代谢重编程、环境感知和耐药机制为生物膜的稳定性和致病性提供多方面的支持。研究确定了lasI基因及其介导的群体感应通路在SMG诱导的生物膜增强中的核心作用，提出了“SMG刺激-lasI表达-AHL信号-生物膜组装”的核心调控轴。这些发现深化了对空间环境中微生物适应性进化机制的理解，为开发针对太空任务中微生物相关风险的防控策略提供了新的理论依据和潜在的分子靶点。