衣藻蛋白核跨膜膜蛋白质组学分析揭示新型组分及其功能特征

《New Phytologist》：Proteomic analysis of the pyrenoid-traversing membranes of Chlamydomonas reinhardtii reveals novel components

本研究通过亲和纯化与质谱技术首次系统鉴定了莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）蛋白核跨膜膜（pyrenoid-traversing membranes）的蛋白质组成，发现包括PME1和LCI16在内的新型膜蛋白组分。研究证实LCI16定位于跨膜膜，且与PME1存在物理互作，并通过突变体实验表明二者虽不影响膜形态建成，但其蛋白质组谱与已知蛋白核突变体相似。该工作为解析蛋白核的CO2浓缩机制（CCM）提供了关键膜蛋白资源，推动了对藻类碳固定细胞器的机制理解。

　　

摘要

蛋白核（pyrenoid）是藻类中负责CO₂固定的细胞器，承担全球约三分之一碳固定任务。其功能依赖于贯穿蛋白基质的膜系统（pyrenoid-traversing membranes），但迄今对该膜的蛋白组成知之甚少。本研究以模式藻类莱茵衣藻为材料，通过膜片段亲和纯化与质谱分析，首次系统鉴定了蛋白核跨膜膜的蛋白质组，发现已知膜蛋白（如RBMP1、RBMP2、CAH3、MITH1）及两个新型候选蛋白：Cre10.g452250（命名为PME1）和Cre02.g143550（LCI16）。进一步功能验证表明，LCI16定位于跨膜膜，且与PME1存在物理互作；尽管缺失PME1或LCI16不影响膜形态或低CO₂条件下的生长，但其蛋白质组谱与已知蛋白核突变体（如cia5、epyc1、mith1、saga1）高度相似，提示二者在CCM调控中可能发挥非结构功能。本研究为揭示蛋白核膜系统的分子机制提供了关键资源。

引言

Rubisco是地球上最丰富的酶，但其催化效率低且易发生氧合反应。许多生物通过CO₂浓缩机制（CCM）提高Rubisco的羧化效率，其中真核藻类普遍利用蛋白核实现CCM。蛋白核通过凝聚Rubisco形成生物分子冷凝物，并在其内部释放高浓度CO₂。莱茵衣藻的蛋白核被淀粉鞘包裹，并由跨膜膜系统贯穿，这些膜管网络与类囊体膜连续但超微结构独特，可能承担CO₂输送与细胞器组织等功能。已知跨膜膜蛋白包括CAH3、MITH1、RBMP1和RBMP2，但其完整蛋白组成仍不明确。

材料与方法

研究采用膜亲和纯化策略：以RBMP1、RBMP2（跨膜膜标志）和CPLD9、CGL129（类囊体膜标志）为诱饵，通过超声破碎替代去垢剂处理，富集膜片段并进行质谱分析。实验共进行三次技术优化（标记自由定量与TMT标记），筛选跨膜膜富集蛋白。同时利用活细胞成像、透射电镜（TEM）、生长实验和全细胞蛋白质组学对候选蛋白进行功能表征。

结果

1. 1.
   膜亲和纯化鉴定跨膜膜蛋白组
   三次实验分别鉴定出22、92和14个跨膜膜富集蛋白（阈值：≥2倍富集）。整合分析获得6个高置信度蛋白，包括已知的RBMP1、RBMP2、CAH3、MITH1和新型蛋白LCI16、PME1。该方法成功捕获了无直接互作但膜共定位的蛋白（如CAH3与RBMP1/RBMP2），验证了策略的有效性。
2. 2.
   LCI16定位于跨膜膜并与RBMP2/PME1互作
   LCI16-Venus-3×FLAG定位于蛋白核中心区域，模式类似于RBMP2。免疫共沉淀显示LCI16与PME1、RBMP2存在物理互作，支持PME1的膜定位。
3. 3.
   PME1与LCI16缺失不影响膜形态与生长
   TEM显示lci16和pme1突变体的跨膜膜结构（中央网状区与外周小管）与野生型无差异。在低CO₂（40–400 ppm）及高光条件下，突变体生长无显著缺陷（除pme1-1等位基因有轻微表型），表明二者非CCM核心结构元件。
4. 4.
   突变体蛋白质组揭示CCM相关调控网络
   全细胞蛋白质组分析发现，lci16和pme1突变体中CCM相关蛋白（如BST2上调，HLA3、CAH5下调）的变化模式与cia5、epyc1等已知CCM突变体相似，提示PME1和LCI16可能参与CCM调控通路。

讨论

本研究建立的膜亲和纯化方法为亚细胞器膜域蛋白组成分析提供了新思路。LCI16作为LHC家族同源蛋白，其与RBMP2的互作及转录同步性暗示其在光响应或膜功能中的特异性作用；PME1含非典型脯氨酸富集域和两性螺旋，可能参与膜结合或形态调控。二者在CCM突变体中的蛋白质组响应表明其或参与碳固定调控网络，但具体机制需进一步探索。

结论

本研究系统性揭示了莱茵衣藻蛋白核跨膜膜的蛋白质组成，发现并初步表征了PME1和LCI16两个新型组分，为理解蛋白核的CO₂浓缩机制提供了分子基础。