CircAASS通过调节肾小管上皮细胞中的线粒体稳态来减轻肾脏损伤和纤维化

《Autophagy》：CircAASS alleviates renal injury and fibrosis by regulating mitochondrial homeostasis in tubular epithelial cells

急性肾损伤（AKI）中环RNA circAASS通过调控线粒体稳态减轻肾纤维化。研究发现circAASS在三种AKI模型中下调，其敲低加剧线粒体损伤、ROS升高及TECs凋亡，而过表达可改善线粒体结构、抑制炎症反应。机制上，胞质circAASS通过海绵化MIR324-3p激活PINK1介导线粒体自噬，核定位的circAASS直接结合PPARGC1A/PGC-1α抑制泛素化降解，促进线粒体生物生成。临床数据显示circAASS与PPARGC1A/PGC-1α及PINK1正相关，与肾损伤程度负相关。IGF2BP2通过结合pre-mRNA抑制circAASS circularization。本研究首次阐明circAASS在AKI-肾纤维化中的双重调控机制，为治疗提供新靶点。

　　急性肾损伤（AKI）是肾脏功能受损的一种常见病理状态，主要表现为肾小管上皮细胞（TECs）的功能障碍，这往往会导致肾纤维化。线粒体功能障碍是多种AKI类型中的一个普遍特征，然而，环状RNA（circRNAs）在AKI期间调节线粒体稳态和随后肾纤维化过程中的潜在作用尚未被充分研究。我们的研究发现，在三种不同的AKI模型中，肾皮质中的circAass水平显著降低。机制研究表明，circAass通过促进线粒体稳态，缓解TECs的凋亡和炎症反应，从而减轻AKI。具体来说，细胞质中的circAass通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制，通过结合MIR324-3p，从而增强PINK1的表达，PINK1是线粒体自噬的关键调节因子。此外，细胞核中的circAass直接与PPARGC1A/PGC-1α蛋白相互作用，抑制其泛素介导的降解，从而促进线粒体生物合成。我们还证明，在AKI小鼠模型中恢复circAass表达可以改善线粒体生物合成和线粒体自噬，从而减轻TECs的促炎反应，从而缓解肾纤维化。在AKI患者中，circAass表达减少与线粒体功能障碍相关，随后出现更严重的肾纤维化。综上所述，我们的研究结果表明，circAass通过调节线粒体稳态保护肾脏，这为肾脏损伤的治疗提供了新的潜在靶点。

在本文中，我们探讨了circAass在急性肾损伤和随后肾纤维化中的关键作用。首先，我们通过分析三种AKI小鼠模型（I/R-AKI、SAKI和CP-AKI）中差异表达的circRNA数据集，发现circAass和circLrrk2在肾组织中均显著下调。为了评估其临床应用潜力，我们比较了人类和小鼠之间circAass的保守性，发现它们的序列有87%的保守性，因此选择了circAass作为进一步研究的对象。circAass是由AASS基因的外显子2到11组成的1293个核苷酸的环状RNA。通过逆转录PCR和桑格测序验证了其环状结构的存在。我们还通过PCR扩增方法确认了circAass在TECs中的表达，而不是在基因组DNA中。RNA酶R抗性分析显示，circAass对RNA酶R消化具有抗性，而线性AASS mRNA则没有。此外，像其他circRNA一样，circAass比其线性对应物AASS mRNA更加稳定。RNA原位杂交（RNA-FISH）实验表明，circAass在TECs的细胞核和细胞质中均存在（图1G）。类似的结论也来自亚细胞分馏实验（图1H）。

接下来，我们通过qPCR分析了circAass在TECs和肾组织中的表达，发现其在受伤的TECs和肾组织中表达水平显著下降（图S1D和S1E）。此外，与对照小鼠相比，I/R-AKI、CP-AKI和SAKI小鼠的肾组织中circAass的表达水平显著降低（图1I和J）。这些数据表明，circAass在体内和体外的受伤TECs中均被下调。为了进一步验证circAass在TECs中的作用，我们进行了电镜观察，发现其在AKI小鼠的肾小管上皮细胞中对线粒体结构的保护作用。此外，我们通过JC-1染色和活性氧（ROS）水平测量来评估线粒体功能和氧化应激标志物。结果表明，circAass的敲低导致HK2细胞的线粒体膜电位（MMP）下降（图2E-G），而circAass的过表达则产生了相反的效果（图2H-J）。敲低circAass显著增加了HK2细胞中的ROS水平（图2K），而circAass的过表达则明显降低了ROS的产生（图2L）。

在进一步研究circAass对线粒体损伤和促纤维化反应的影响时，我们发现circAass的敲低增加了HK2细胞的凋亡率，而其过表达则减少了凋亡（图3A-D）。此外，circAass的调控也影响了促炎反应，表现为IL1B、CCL2和TNF等促炎细胞因子的表达变化（图3E、F）。为了观察circAass对HK2细胞促纤维化效应的影响，我们收集了不同处理条件下的培养基，并与成纤维细胞共培养（图3G）。进一步分析显示，使用circAass敲低培养基的成纤维细胞中，促纤维化因子如FN1、ACTA2/αSMA和COL1A/collagen I的水平显著增加（图3H）。相反，使用circAass过表达培养基的成纤维细胞中，这些促纤维化因子的表达水平显著降低（图3I）。这些数据表明，circAass能够减轻受伤TECs的线粒体损伤和促纤维化反应。

为了深入了解circAass的分子机制，我们通过RNA免疫共沉淀（RIP）实验发现，circAass与AGO2蛋白有显著的结合（图4A），这表明circAass可能通过结合AGO2来调节miRNA的表达。进一步的生物信息学分析筛选出circAass可能结合的miRNA，其中MIR324-3p和MIR345-5p被预测为同时靶向PINK1的3'UTR（图4F）。我们还进行了荧光素酶报告基因实验，发现MIR324-3p模拟物显著抑制了PINK1-3'UTR或circAass的荧光素酶活性，而MIR345-5p模拟物则没有这种效果（图4G、H）。这些效应在使用突变的circAass或PINK1-3'UTR后被逆转（图4I、J）。此外，亲和纯化实验显示，circAass直接结合MIR324-3p（图4K），而RNA原位杂交实验进一步验证了circAass与MIR324-3p在HK2细胞细胞质中的共定位（图4L）。因此，这些结果表明，circAass通过作为MIR324-3p的海绵，直接结合MIR324-3p，从而促进线粒体自噬。

在细胞核中，我们发现circAass能够通过直接结合PPARGC1A/PGC-1α蛋白，抑制其泛素介导的降解，从而促进线粒体生物合成。通过RNA亲和纯化实验，我们确认了circAass与PPARGC1A/PGC-1α的相互作用，并进一步通过Western blot和RIP实验验证了这一结果（图5A、B）。我们还通过截断突变和亲和纯化实验，发现circAass的特定序列（518-776 nt）与PPARGC1A/PGC-1α的结合能力有关（图5G、H）。为了验证circAass对PPARGC1A/PGC-1α表达的影响，我们使用了蛋白酶体抑制剂MG132，发现其对PPARGC1A/PGC-1α蛋白水平的促进作用被抑制（图5K、L）。进一步的实验表明，circAass的过表达抑制了PPARGC1A/PGC-1α的泛素化，而circAass突变体的过表达则未能调节PPARGC1A/PGC-1α的泛素化（图5M）。这些数据表明，circAass通过抑制PPARGC1A/PGC-1α的泛素/蛋白酶体依赖性降解，从而稳定PPARGC1A/PGC-1α蛋白，促进线粒体生物合成。

在研究circAass的调控机制时，我们发现IGF2BP2是其生物合成的负调控因子。通过转录组分析，我们发现IGF2BP2在AKI小鼠的肾组织中显著上调，而其他三个候选RNA结合蛋白（RBPs）则保持不变（表S2）。这一结果在AKI小鼠的肾组织中得到进一步验证（图6A-F）。此外，IGF2BP2在H/R、cisplatin或LPS处理的原代TECs中也显著上调（图6G、H）。通过分析IGF2BP2在Aass前mRNA中的结合位点，我们发现IGF2BP2结合于CSI11-Aass，而不是CSI1-Aass（图6I）。进一步的实验表明，通过siRNA敲低IGF2BP2可以恢复circAass的表达（图6K-M），而IGF2BP2的过表达则会降低circAass的表达，而不影响Aass mRNA和前mRNA的表达（图6N）。这些发现表明，IGF2BP2通过结合Aass前mRNA的内含子11，抑制circAass的形成，这一过程与m6A修饰无关。

为了进一步验证circAass在AKI中的治疗潜力，我们使用腺相关病毒9（AAV9）系统在TECs中过表达circAass，并使用一个与Cdh16/Ksp-cadherin启动子相关的载体进行特异性表达。此外，我们还共表达荧光素酶报告基因以评估其在肾脏中的递送效率。在I/R-AKI、CP-AKI和SAKI小鼠模型中，AAV9-circAass处理显著改善了肾功能，并降低了急性小管损伤评分（图7E-I）。通过DHE染色，我们发现circAass的过表达显著改善了I/R-AKI和CP-AKI小鼠的TECs线粒体功能，降低了ROS水平（图7C）。此外，circAass的过表达还增加了PINK1和PPARGC1A/PGC-1α等线粒体相关蛋白的表达（图7L、M），并减少了成纤维细胞的浸润，抑制了促炎分子的表达（图7P-R）。这些结果表明，circAass在AKI中通过改善线粒体稳态，减轻了TECs的损伤。

为了验证circAass在AKI后肾纤维化中的作用，我们使用AAV9-circAass处理了I/R-AKI和CP-AKI小鼠模型，并在术后3周评估了其效果。结果显示，circAass的过表达显著降低了肾组织中的纤维化程度（图8H、I），并减少了促纤维化因子如ACTA2/αSMA、FN1和COLIA的表达（图8J-M）。此外，circAass的过表达还改善了肾功能（图8N）。这些数据进一步支持了circAass在AKI后肾纤维化中的保护作用。

在临床研究中，我们对AKI和CKD患者的肾活检样本进行了横断面分析，探讨circAass表达水平与线粒体稳态参数之间的关系。结果表明，circAass在AKI患者的肾组织中显著下调，而PPARGC1A/PGC-1α和PINK1的表达也显著减少，同时ROS水平升高（图9A-E）。此外，我们发现circAass的表达与PPARGC1A/PGC-1α和PINK1的表达呈正相关（图9F、G），而与DHE染色评分和急性小管损伤评分呈负相关（图9H、I）。在CKD患者的肾组织中，circAass、PPARGC1A/PGC-1α和PINK1的表达也显著减少，同时ROS水平升高（图9J-N）。这些发现进一步支持了circAass在AKI和CKD中的重要作用。

通过这些研究，我们发现circAass在AKI中通过双重机制（线粒体自噬和线粒体生物合成）维持线粒体稳态，从而减轻TECs的损伤和肾纤维化。这一研究为肾损伤的治疗提供了新的思路，即通过调节circAass的表达，可以有效改善线粒体功能，从而减少炎症和纤维化。此外，circAass的表达受到IGF2BP2的调控，这一发现扩展了IGF2BP2的功能范围，为未来研究提供了新的方向。虽然circAass的过表达在小鼠模型中显示出良好的治疗效果，但进一步的临床研究和安全性评估仍然是必要的。