通过酶嵌入铁蛋白的自组装形成的生物催化三维二元晶体

《Nanoscale》：Biocatalytic 3D binary crystals formed through the self-assembly of enzyme-embedded ferritin

蛋白晶体通过静电共结晶组装，将含过氧化酶APEX2的纳米笼与正电纳米笼形成有序面心立方结构，保持催化活性并实现可重复使用。

　　蛋白质晶体在传统上主要用于结构分析，但近年来因其固有的有序性、定义良好的孔隙结构以及高度的化学可编程性而逐渐成为功能性材料的重要研究对象。这种转变源于科学家们对蛋白质晶体在催化、传感和纳米制造等领域的潜在应用的深入探索。蛋白质晶体不仅具有分子级别的有序排列，还能提供高度可控的化学环境，使其在构建具有特定功能的材料方面展现出独特的优势。尤其是当这些晶体被赋予催化活性时，它们在保持结构稳定的同时，还能实现对反应条件的精确调控，为研究复杂的生物催化过程提供了新的思路。

在众多可用于构建功能性蛋白质晶体的结构中，蛋白质笼体（protein nanocages）因其模块化、均一性和可调控的表面化学特性而备受关注。例如，铁蛋白（ferritin）和病毒衣壳（如豇豆黄斑病毒CCMV）都是研究中的重要对象。这些笼体不仅可以作为纳米尺度的封装单元，还能通过精确的表面修饰和相互作用调控，实现对内部负载物的精准控制。这种特性使得蛋白质笼体成为构建具有高度有序性和功能性的晶体材料的理想选择。通过将不同的功能性酶或催化剂嵌入这些笼体中，科学家们能够设计出具有特定催化性能的复合材料，从而拓展了蛋白质晶体在生物催化领域的应用范围。

然而，现有的大多数系统仍然依赖于晶体形成后的负载或非特异性吸附，这种方式难以实现对催化成分的空间分布、取向和负载密度的精确控制。因此，缺乏对晶体结构与催化性能之间关系的系统研究，限制了功能性蛋白质晶体的发展。为了解决这一问题，研究团队提出了一种基于电荷相互作用的蛋白质晶体共结晶策略，通过电荷互补的铁蛋白纳米笼体实现催化活性的有序排列。这种方法不仅能够有效保持酶的活性，还能通过晶体结构的调控，实现对催化反应环境的精确设计。

具体而言，研究人员选择了来自 *Archaeoglobus fulgidus* 的铁蛋白（AfFt）作为负电荷载体，因为它具有独特的结构和表面电荷特性，能够在温和条件下高效封装蛋白质。AfFt 的结构由24个亚基组成，形成一个四面体结构，其内部具有较大的三角形开口（约4.5纳米），这为酶的封装提供了便利。此外，AfFt 在中性pH和低离子强度条件下可以可逆地解离为二聚体，从而允许在不破坏笼体结构的情况下访问其内部空间。研究人员通过将超带电的绿色荧光蛋白（GFP+36）与酶 APEX2 融合，构建了一种具有高正电荷的融合蛋白，该蛋白能够通过静电相互作用被AfFt封装，形成具有催化活性的AfFt@结构。

为了进一步构建功能性蛋白质晶体，研究团队还设计了一种带有正电荷的铁蛋白变体（pFt），通过在每个亚基表面引入多个赖氨酸或精氨酸残基，从而在溶液中形成一个带有净正电荷的结构。当pFt与AfFt@结合时，它们通过静电相互作用形成二元蛋白质笼体晶体。这种电荷驱动的自组装策略使得研究人员能够以模块化的方式构建具有精确结构和集成功能的催化材料。通过调整溶液中的电解质浓度，可以进一步调控静电相互作用的强度，从而控制纳米笼体的组装方式和晶体的形成过程。

在实验中，研究人员利用动态光散射（DLS）技术监测了不同盐浓度下蛋白质笼体的自组装行为。结果显示，当盐浓度较低时，AfFt@和pFt之间的相互作用较强，导致形成较大的超分子复合物；而随着盐浓度的增加，静电相互作用逐渐被屏蔽，最终导致复合物的解离。这一现象表明，盐浓度是调控蛋白质晶体自组装过程的关键因素之一。进一步的单颗粒三维重构分析和小角X射线散射（SAXS）数据则提供了更详细的结构信息，证明了AfFt@和pFt在225 mM NaCl条件下形成了具有面心立方（FCC）结构的晶体。这种结构不仅具有高度的有序性，还能够通过不同的封装方式实现功能组件的精确排列。

在催化性能方面，研究人员通过2-甲氧基苯酚氧化反应评估了AfFt@–pFt晶体的活性。实验结果表明，封装后的APEX2-GFP+融合蛋白在晶体结构中仍然保持了较高的催化效率，其比活性（k_cat）约为自由融合蛋白的80.4%。这一结果说明，虽然封装过程可能对酶的活性产生一定影响，但总体而言，催化性能并未受到显著削弱。此外，通过多次催化循环的测试，研究人员发现这些晶体材料在多次使用后仍能保持稳定的催化活性，显示出良好的可重复使用性。这进一步验证了蛋白质晶体作为异质催化剂的潜力，其结构稳定性和功能保留性为实际应用提供了重要保障。

为了验证晶体材料的可回收性，研究人员通过离心法分离反应混合物中的晶体，并在后续实验中加入新的反应底物。结果表明，晶体在多次循环后仍能保持较高的催化活性，证明了其在实际应用中的可靠性。值得注意的是，当溶液中加入过量的NaCl时，晶体结构会逐渐解离，封装的AfFt@笼体重新释放到溶液中，这表明晶体材料具有一定的可逆性。而相比之下，未封装的AfFt@笼体在离心后无法再进行催化反应，进一步突显了晶体结构对酶稳定性和功能保持的重要性。

这一研究不仅为构建功能性蛋白质晶体提供了新的方法，也为探索生物催化过程中的空间调控提供了重要的实验基础。通过将不同的催化组件有序地排列在晶体结构中，研究人员能够设计出具有特定反应路径和协同效应的复合材料。这种有序排列不仅有助于提高催化效率，还能为研究多步骤生物催化反应和人工代谢网络提供新的平台。此外，这种晶体材料在生物传感、生物修复和合成生物学等领域也展现出广阔的应用前景。例如，在生物传感中，晶体结构可以增强信号传递效率，通过引导反应性物质的扩散路径，提高检测的灵敏度；在生物修复中，晶体可以为酶提供保护，使其在恶劣的环境条件下仍能保持活性；而在合成生物学中，晶体结构可以用于精确控制酶之间的距离，从而实现更高效的级联催化反应。

研究团队还指出，这种基于电荷互补的蛋白质晶体共结晶策略具有良好的可扩展性，能够为未来的多功能材料设计提供灵感。通过调整蛋白质笼体的电荷分布、尺寸和表面修饰，研究人员可以进一步优化晶体的结构和功能，从而满足不同应用场景的需求。此外，该方法还能够与其他蛋白质工程策略相结合，如引入金属氧化物纳米酶等新型催化剂，从而构建更复杂的生物催化系统。这些创新为推动蛋白质晶体在生物技术领域的应用奠定了坚实的基础。

总的来说，这项研究通过一种新颖的蛋白质晶体共结晶策略，成功构建了一种具有高度有序结构和催化活性的二元蛋白质晶体。这种材料不仅保留了酶的活性，还具备良好的可重复使用性和结构稳定性，为未来的多功能生物催化系统提供了重要的实验支持。研究团队相信，随着对蛋白质晶体结构与功能关系的进一步探索，这种材料将在生物技术、环境工程和医学等领域发挥更大的作用。未来的工作可以聚焦于提高晶体的催化效率、优化其结构设计，以及探索其在实际应用中的性能表现。这些努力将进一步推动蛋白质晶体从实验室研究走向实际应用，为人类社会带来更多的创新和突破。