Stramoniumlides A和B：从Datura stramonium L的叶子中提取的两种新的含氮Withanolides化合物

《Bioorganic Chemistry》：Stramoniumlides a and B: Two new nitrogen-containing Withanolides from the leaves of Datura stramonium L

抗炎活性新withanolides的分离与分子机制研究，鉴定了Datura stramonium叶中13种新型氮代withanolides（1-13）及14个已知衍生物（14-27）。通过NMR和MS确认结构，活性筛选显示化合物2显著抑制TNF-α和IL-6分泌（IC50=8.04 μM）。分子对接和ITC实验表明化合物2与TLR4蛋白结合能-11.2 kcal/mol，KD=15.8×10?? M，并通过免疫荧光和Western blot验证其抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路。

　　

Juan Pan|Si-Yi Wang|Dan-Ni Wang|Meng-Meng Li|Jia-Tong Wu|Qing-Shan Chen|Li-Li Zhang|Hai-Xue Kuang|Xiao-Chi Ma|Yan Liu

北药基础与应用研究重点实验室（黑龙江中医药大学），教育部+中药生物遗传学（黑龙江省双一流建设交叉学科），中国哈尔滨

摘要

从Datura stramonium L.的叶子提取物中鉴定了13种新的威诺醇类化合物（stramoniumlides A-M，1?13）以及14种先前已知的类似物。值得注意的是，化合物1和2是含有氮的威诺醇类化合物，它们首次在甾体结构中连接了腺嘌呤和脯氨酸。结构鉴定通过详细的光谱分析完成，包括NMR和MS技术，并结合已发表的光谱数据进行构型确定。生物测定结果显示，活性成分1、2、10、22和26对LPS刺激的BV2细胞的NO产生的抑制作用比阳性对照成分更强（IC₅₀ = 8.04 μM）。其中，化合物2显著抑制了TNF-α和IL-6的产生。在分子对接分析中，化合物2对TLR4蛋白表现出强烈的亲和力，结合能为-11.2 kcal/mol，这一结果通过等温滴定量热（ITC）测定的K_D值15.8 × 10^-6 M得到了进一步验证。同时，免疫荧光实验表明化合物2显著抑制了TLR4的表达。此外，Western blotting实验用于评估TLR4/MyD88/NF-κB通路的抑制作用，从而阐明了其抗炎作用的分子机制。

引言

威诺醇类是一类独特的甾体化合物，其特征是具有C₂₈骨架、丰富的氧化模式以及以麦角甾烷为基础的骨架。大多数威诺醇类存在于茄科（Solanaceae）植物中，如Withania、Physalis、Datura、Dunalia和Jaborosa等属。由于其复杂的结构和显著的生物活性（包括抗肿瘤、抗炎、抗增殖、免疫调节、驱虫和抗菌作用），威诺醇类引起了有机化学和药理学研究人员的关注[[1], [2], [3], [4]]。

作为茄科植物的一员，Datura stramonium L.是一种重要的药用植物，在中国广泛分布，是威诺醇类代谢物的丰富来源。几个世纪以来，D. stramonium的叶子在中医中被用于治疗哮喘、痉挛、疼痛和风湿等疾病[[5], [6], [7], [8]]。为了研究茄科植物中结构独特且具有生物活性的威诺醇类，我们对D. stramonium的叶子进行了详细的植物化学研究[9,10]，从中分离出了13种先前未报道的威诺醇类化合物（stramoniumlides A–M，1–13）以及14种已知的类似物（14–27）（图1）。值得注意的是，化合物1和2分别是含有腺嘌呤和脯氨酸残基的稀有含氮威诺醇类化合物。基于D. stramonium叶提取物及威诺醇类天然产物的抗炎特性[[11], [12], [13]]，我们使用LPS诱导的BV-2小胶质细胞模型系统评估了这些化合物的抗炎潜力。然而，这些化合物的确切作用靶点和机制，尤其是它们与关键炎症途径之间的相互作用，尚未得到充分研究。鉴于TLR4及其下游的MyD88/NF-κB信号通路在LPS诱导的炎症过程中起核心调控作用，我们推测初步筛选中观察到的强抗炎活性可能源于对该通路的直接调控。为了实验性地阐明这些生物活性成分的分子机制，我们采用了一系列分析技术，包括计算分子对接研究、等温滴定量热（ITC）、细胞免疫荧光成像和蛋白质免疫印迹分析。本研究描述了这些新鉴定威诺醇类的纯化、结构表征和抗炎评估，为它们作为抗炎剂的潜力提供了有价值的见解。

实验方法

一般实验程序

光学旋转测量使用的是由日本东京Jasco公司制造的JASCO P-1020数字旋光仪。GC–MS分析在Agilent 7890 A系统上进行，该系统使用DB-5毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），并以氮气作为载气。进样口和检测器的温度保持在280°C，柱温以5°C/min的速率从160°C升高到195°C。CD光谱使用Bio-Logic仪器获得。

结构鉴定

stramoniumlide A（1）被分离为一种白色无定形粉末，其分子式为C₃₉H₅₃N₅O₁₀，通过负HR-ESI-MS（m/z 796.3760 [M + HCOO]^?，计算值796.3774）确定。对1的NMR数据（表1，表3）的分析显示，其具有1-氧代-5-烯威诺醇类骨架的特征信号。具体来说，¹H NMR谱在δ_H 6.17处显示一个信号（1H，d，J = 4.6 Hz，H-6），而¹³C NMR谱在δ_C 208.7处显示出共振峰。

CRediT作者贡献声明

Juan Pan：撰写原始草稿、项目管理和概念设计。Si-Yi Wang：方法学设计和实验研究。Dan-Ni Wang：方法学设计和实验研究。Meng-Meng Li：数据可视化与软件处理。Jia-Tong Wu：软件开发和资源获取。Qing-Shan Chen：资金申请。Li-Li Zhang：资金申请。Hai-Xue Kuang：实验监督和概念指导。Xiao-Chi Ma：实验研究。Yan Liu：项目行政。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（NSFC）（编号82204596）、黑龙江省“双一流”学科协同创新建设项目（LJCXCG2024-F28和LJGXCG2022-096）以及黑龙江省春雁创新团队计划（编号2022CYQN0044）的支持。