肠杆菌(Enterobacter cloacae)四模块裂解性多糖单加氧酶通过域间铜配位调控其活性的研究

《Journal of Biological Chemistry》：Regulation of the activity of a tetra-modular lytic polysaccharide monooxygenase from Enterobacter cloacae by inter-domain copper coordination

　　

肠杆菌(Enterobacter cloacae)是一种栖息于多种生态位的革兰氏阴性医院内人类病原体。其基因组编码一组保守的推定几丁质活性酶，包括一种裂解性多糖单氧合酶(Lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO)，称为EcLPMO，研究人员在本研究中对其进行了功能表征。EcLPMO是一种四模块蛋白，由一个辅助活性家族10(Auxiliary Activity family 10, AA10)催化结构域、两个未知功能中心结构域(DUF-A和DUF-B)以及一个C端碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Module, CBM73)组成。使用全长EcLPMO及其截短变体进行的功能测定表明，AA10结构域在C1位点氧化切割几丁质。CBM73模块增强了几丁质结合并促进与内源性几丁质酶的协同作用。EcLPMO与单模块几丁质酶EcChiA表现出协同作用，导致从α-和β-几丁质释放的GlcNAc分别增加高达14倍和60倍。删除两个DUF会降低EcLPMO活性。虽然DUF-A单独以及DUF-A和DUF-B的联合显示出有限的几丁质结合，但DUF-B单独未显示结合，表明其具有不同作用。利用AlphaFold3，研究人员观察到DUF-B结构域包含两个高度保守的组氨酸，它们配位AA10结合的铜，形成先前未报道的“域间四组氨酸铜配位”中心。这些发现突出了EcLPMO的结构和功能性复杂性，并表明其附属结构域特别是DUF-B可能有助于酶稳定性和底物相互作用。研究人员推测DUF-B可能保护LPMO活性位点免受氧化损伤，这一特征在其生态和致病背景下可能至关重要。

本研究围绕革兰氏阴性院内病原菌肠杆菌(Enterobacter cloacae)基因组中编码的一种保守多模块裂解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO)即EcLPMO展开。研究背景方面，LPMO作为依赖铜的酶，通过氧化机制裂解结晶多糖如几丁质和纤维素的糖苷键，其活性位点含有由两组氨酸组成的组氨酸支架(histidine brace)配位的单核铜离子。目前LPMO多见于AA9至AA17家族，其中AA10家族在细菌、病毒、植物和真菌中广泛分布且多作用于几丁质。尽管已知许多LPMO具有多模块结构，包含碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Module, CBM)、糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase, GH)结构域等以调节结合亲和力、催化效率和稳定性，但关于AA10 LPMO中未知功能结构域(Domain of Unknown Function, DUF)的具体作用及其域间相互作用机制仍不明确。此外，若干细菌AA10 LPMO已被证实与毒力相关，而EcLPMO作为肠杆菌中保守的单拷贝多模块AA10 LPMO，其模块组织与毒力相关LPMO如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的GbpA、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的CbpD相似，暗示其可能在宿主-病原体互作中具有生物学重要意义，但其功能与结构调控机制尚待阐明。

研究人员对EcLPMO进行了系统的生物信息学分析、蛋白截短变体构建与表达纯化、生化功能测定及结构预测。研究发现EcLPMO全长484个氨基酸，包含N端信号肽、AA10催化域、DUF-A、DUF-B及CBM73。通过截断变异体对比，证实AA10域在C1位氧化切割几丁质，CBM73显著增强几丁质结合及对α-和β-几丁质的亲和性，并与内源性几丁质酶EcChiA产生显著协同效应，最高使GlcNAc释放提升14倍和60倍。删除DUF-A与DUF-B会降低酶活性，且DUF-B几乎无结合能力。利用AlphaFold3建模发现DUF-B含两个保守组氨酸，可与AA10域的两组氨酸形成此前未报道的域间四组氨酸铜配位中心，推测该构象可能在溶液中锁定活性位点以保护其免受氧化自失活，底物结合或氧化还原状态变化可能诱导其解锁为催化活性态。该研究揭示了多模块LPMO结构复杂性及附属域在稳定性与调控中的新机制，对理解LPMO在营养获取与致病适应中的功能具有重要意义。论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：对46株肠杆菌(Enterobacter cloacae)完成基因组的生物信息学分析以注释几丁质活性碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active enZymes, CAZymes)并预测结构域边界；使用IQ-Tree构建AA10催化域及CBM73的系统发育树；通过AlphaFold3服务器在有无Cu(II)条件下对成熟EcLPMO及突变体进行结构预测并提取置信度指标；在大肠杆菌(Escherichia coli)中克隆、表达并纯化EcLPMO全长及截短变体、独立结构域及EcChiA、EcChiB几丁质酶；利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析氧化产物，Amplex Red法检测过氧化氢生成，高性能阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)定量产物；通过时间进程与等温结合实验评估几丁质结合动力学与亲和力；开展EcLPMO与几丁质酶的协同降解实验并定量GlcNAc及(GlcNAc)₂释放。

研究结果如下：

2.1. Bioinformatic analyses of EcLPMO

通过对EcLPMO序列与系统发育分析，确认其为484氨基酸四模块蛋白，AA10催化域与已知几丁质活性AA10聚为一支，保留组氨酸支架残基His1和His88，DUF-A与DUF-B与GbpA等毒力LPMO对应域有一定同源性，CBM73与已表征PaCBM73、VcaCBM73结构高度相似且同属紫色超支系。

2.2. Comparison of CBM73 substrate-binding surfaces and sequence features

比较EcCBM73、VcaCBM73、PaCBM73及CjCBM73的底物结合面发现，EcCBM73具有最宽结合表面约31.1 ?，序列标志显示关键位点如第2位脯氨酸保守，但第3、7、10、12位存在分化，提示CBM73在折叠保守基础上通过环长与残基化学性差异实现底物识别与结合特性的适应性多样化。

2.3. EcLPMO can degrade chitin

MALDI-TOF-MS验证EcLPMO^FL在抗坏血酸存在下从α-和β-几丁质释放C1氧化几丁寡糖(aldonic acids)，偏好偶数链DP2至DP10；全长酶效率高于EcLPMO^CD与EcLPMO^ΔCBM73，去除CBM73几乎消除活性；Amplex Red显示EcLPMO^FL以可比速率还原O₂为H₂O₂，截短变体速率相近约2-3×10^-3 s^-1，脱铜酶仅残基活性。

2.4. EcCBM73 is crucial for efficient chitin binding

结合实验显示EcCBM73在10分钟内结合α-和β-几丁质达89.3%和86.9%，EcLPMO^FL最大结合约55%需60分钟，截短变体仅38–57%；定量等温线表明截短使K_d升高、B_max在α-几丁质略升，对β-几丁质亲和显著下降；DUF-A+B与DUF-A在高pH有微弱结合，DUF-B无显著结合，突显CBM73对结合动力学与容量的关键作用及模块删除导致底物选择性丧失。

2.5. EcLPMO^FL boosts the activity of E. cloacae chitinases

协同实验表明EcLPMO^FL显著提升EcChiA与EcChiB对α-和β-几丁质的降解，与EcChiA协同使GlcNAc释放增加14倍与60倍，与EcChiB协同使(GlcNAc)₂增加2倍与1.6倍，故后续选用EcChiA进行截短变体实验。

2.6. Deletion of EcCBM73 impairs the synergistic activity of EcLPMO with chitinases

对比EcLPMO^FL、EcLPMO^ΔCBM73与EcLPMO^CD与EcChiA的协同，截短变体在α-几丁质24小时GlcNAc产率减半，(GlcNAc)₂降约2.6–2.9倍；β-几丁质GlcNAc降5.5倍，EcLPMO^CD几乎无产物，证明CBM73对维持并增强协同作用不可或缺。

2.7. The chitinolytic machinery of Enterobacter cloacae

基因组背景揭示肠杆菌具复杂几丁质降解系统，含2个GH18、2个GH19几丁质酶、2个β-N-乙酰己糖胺酶(GH3、GH20)及1个CE4多糖脱乙酰酶；EcLPMO与EcHexA(GH20)共操纵子，EcChiB与EcChiC邻II型分泌系统，多数具N端信号肽提示胞外分泌且在菌株间保守，EcLPMO为最保守组件之一，图示提出溶液中四模块EcLPMO呈锁定构象由AA10与DUF-B四组氨酸配位铜，几丁质存在时通过AA10与CBM73结合转为伸长解锁态，多模块形式比单体催化域更耐氧化失活。

讨论部分总结：研究人员指出EcLPMO为GbpA型LPMO，保守分布于肠杆菌菌株暗示功能不可或缺；其CBM73强结合几丁质并通过促进底物结合防止LPMO氧化自失活以维持协同潜力；DUF-A与DUF-B几无结合能力，但AlphaFold3预测DUF-B两保守组氨酸与AA10两组氨酸形成域间四组氨酸铜配位中心，该构象在突变或不含Cu(II)时丢失，且铜存在提升DUF-A与DUF-B相对定位置信度，可能在溶液中锁定活性位点保护组氨酸支架免受氧化损伤，并在底物结合或Cu(II)还原为Cu(I)时解锁为催化态；全长与截短酶产H₂O₂速率相似提示还原条件下四组氨酸配位可能破坏，与单域LPMO中Cu(II)配位水被DUF-B组氨酸取代、Cu(I)丢失一位配位相一致；该多模块结构与底物诱导构象转换可能为微生物调控LPMO活性的新策略；EcLPMO及其几丁质降解系统可能助其在几丁质丰富环境如土壤或宿主生态位中获取营养，模块多样与同源毒力蛋白序列分化暗示其他生理作用待阐明；总之EcLPMO为具几丁质结合与氧化活性、与内源几丁质酶协同的多模块LPMO，其域间四组氨酸铜配位中心拓展LPMO结构多样性认知，为氧化还原调控与稳定性机制提供新见解，保守性提示其在营养获取与生态适应中具更广泛意义，是未来多模块LPMO结构功能研究的有价值模型。

研究结论部分翻译：总之，EcLPMO代表了一种具有几丁质结合与氧化活性的独特多模块LPMO，并与内源性几丁质酶发挥协同作用。其各模块的独特贡献，包括推定的域间四组氨酸铜配位中心，拓展了我们对LPMO结构多样性的理解，并为氧化还原调控与稳定性的可能机制提供了见解。EcLPMO在肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株间的保守性暗示了更广泛的生物学意义，可能与营养获取及适应多样生态位有关。总体而言，EcLPMO可作为未来多模块LPMO结构与功能研究的宝贵模型。