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在细菌感染治疗中，抗菌化合物至关重要，但沙门氏菌的应激耐受性和持留菌对其疗效影响不明。研究人员通过小鼠感染模型和组织模拟恒化器，发现营养饥饿是导致抗生素清除沙门氏菌效果不佳的主因。这一成果为优化抗菌治疗提供了关键依据。
在细菌感染的治疗领域，抗菌化合物一直是对抗细菌的有力武器，然而，它们在实际应用中的效果却常常不尽人意。就拿侵袭性沙门菌病来说，这是一种严重的感染性疾病，每年约有 1500 万患者受其困扰，20 万人因此失去生命 。治疗这种疾病的推荐杀菌抗生素，如氟喹诺酮类（fluoroquinolones ）和头孢菌素类（cephalosporins ），在实验室检测中，即便沙门氏菌对其敏感，但在临床治疗时却很难彻底清除病菌，导致治疗失败。以往，这种治疗失败常被归咎于细菌应激诱导的耐受性（tolerance）和持留菌（persisters），但这些因素在生理条件下的具体影响程度却并不清楚。
为了解开这些谜团，来自瑞士巴塞尔大学（University of Basel）生物中心的研究人员 Joseph Fanous、Beatrice Claudi 等人开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature》杂志上，为理解细菌对抗生素的抗性机制带来了新的突破。
研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先是建立小鼠感染模型，选用 10 - 16 周龄的雌性 BALB/c 小鼠，通过尾静脉注射感染表达绿色荧光蛋白（GFP）的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium） ，模拟人体感染情况；其次，利用组织模拟恒化器，设置与小鼠体内相似的环境参数，如 10% 氧气、5% 二氧化碳、pH 5.6 等，研究沙门氏菌在类似体内环境下对抗生素的反应；此外，运用单细胞实时检测技术，借助表达 recAR29A-mCherry 融合蛋白的沙门氏菌，实时监测 DNA 双链断裂（DSBs）情况，以此来评估抗生素对细菌的损伤作用 。
低效的杀菌效果
研究人员给感染沙门氏菌的小鼠使用推荐剂量的恩诺沙星（enrofloxacin）和头孢曲松（ceftriaxone）后发现，这两种抗生素在小鼠体内对沙门氏菌的杀菌效果远不如在标准实验室条件下。恩诺沙星处理 1 小时后，小鼠脾脏中沙门氏菌的菌落形成单位（CFUs）仅减少约 20 倍，比标准实验室条件下慢约 300 倍；头孢曲松处理 4 小时后，CFUs 减少约 8 倍，比标准实验室条件下慢约 40 倍。这表明，在实际感染情况下，这两类抗生素清除沙门氏菌的能力较差，且并非由细菌产生抗性所致。
多种应激因素的有限影响
为了找出影响抗生素抗沙门氏菌活性的因素，研究人员在恒化器中模拟沙门氏菌在组织中的微环境。结果发现，多种与感染相关的条件，如酸性 pH、葡萄糖、氧化应激、亚硝化应激、抗菌肽、渗透压、氧气限制、二氧化碳和碳酸盐，以及药物外排、毒素 - 抗毒素模块和细胞大小等，对恩诺沙星和头孢曲松的活性影响有限。而营养获取则起着关键作用，限制营养供应会使沙门氏菌生长缓慢，显著降低抗生素的杀菌效果；反之，充足的营养供应能加快沙门氏菌的复制，增强抗生素的杀菌作用。
CFUs 的双相损失
在研究过程中，头孢曲松对沙门氏菌的杀伤呈现出持续的缓慢损失活力的现象，而恩诺沙星则表现出双相动力学，即最初 1 小时内可杀死约 95% 的沙门氏菌，随后剩余的沙门氏菌以较慢的速度失去活力。这种双相动力学曾被认为是存在一小部分具有抗性的沙门氏菌（持留菌）阻碍了抗生素清除的证据，但传统的 CFU 检测方法存在误导性。
缓慢的单相 DNA 损伤
为了更准确地监测恩诺沙星的活性，研究人员利用表达 recAR29A-mCherry 的沙门氏菌进行实时检测。结果发现，恩诺沙星诱导的 DNA 损伤是缓慢且单相的，与 CFU 数据不一致。在 4 小时的恩诺沙星处理过程中，只有约 15% 的细胞在 1 小时内经历了关键的初级 DSB，但 CFU 却下降了 20 倍；而且损伤是单指数的，而 CFU 的下降却是双指数的。这说明传统 CFU 检测方法并不能准确反映抗生素对细菌的损伤情况。
暴露后的大量损伤
研究人员进一步发现，恩诺沙星处理后的沙门氏菌在富含营养的 LB 琼脂平板上生长时，会出现大量的 DNA 损伤和细胞死亡，这解释了为什么 CFU 数据会出现误导。在模拟体内情况的实验中，在营养匮乏的培养基中培养沙门氏菌，并给予逐渐减少的恩诺沙星浓度，结果显示，沙门氏菌的修复和存活率更高，这表明生理饥饿减缓了细菌的生长，减少了损伤，为 DNA 修复提供了更多时间。
小鼠体内的缓慢单相 SOS 反应
在小鼠实验中，研究人员通过携带 Pcad-gfp 融合蛋白的报告菌株监测沙门氏菌对 DNA 损伤的 SOS 反应。结果发现，恩诺沙星处理后，沙门氏菌的 SOS 反应是缓慢且单指数的，与 CFU 数据不符。大多数 DNA 损伤、SOS 反应和活力丧失发生在恩诺沙星处理后的生长阶段，这进一步证实了 CFU 数据的不可靠性。而且，营养匮乏的培养基能提高受恩诺沙星毒害但最初存活的沙门氏菌的存活率，这表明 CFU 数据会低估存活的沙门氏菌数量。
营养缺陷型和持留菌的影响
研究人员还测试了两个据报道影响持留菌形成的基因等位基因。结果发现，组氨酸营养缺陷型对沙门氏菌在体内的抗生素存活没有影响；而增加持留菌频率的 ShpBQ97*突变体，在体内对抗生素的存活也没有明显影响。这表明，在大量沙门氏菌广泛存活的情况下，少数高抗性持留菌子集的影响是有限的。
研究表明，营养饥饿是导致抗生素清除沙门氏菌效果不佳的主要原因，而非以往认为的细菌应激诱导的耐受性和持留菌。传统的 CFU 检测方法存在误导性，不能准确反映抗生素的活性和细菌的存活情况。未来的抗生素研发应模拟营养匮乏的条件，同时，在研究细菌对抗生素的反应时，应采用更准确的单细胞实时检测方法。这些发现为优化抗菌治疗策略、提高细菌感染的治疗效果提供了重要的理论依据，有助于推动抗菌药物领域的进一步发展，对解决临床上细菌感染治疗难题具有重要的指导意义。
