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本文聚焦隐球菌病疫苗研发，构建编码隐球菌抗原的 mRNA 脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs）。研究发现，CDA1-LNPs 联合胶囊佐剂可保护多数小鼠抵御致命隐球菌感染，为开发抗真菌 mRNA-LNP 疫苗提供关键依据，推动该领域研究进展。
一、研究背景
隐球菌（Cryptococcus neoformans）是世界卫生组织认定的重要真菌病原体，可引发免疫功能低下者致命的脑膜脑炎。每年因该病死亡人数超 11.2 万，即便接受抗真菌治疗，全球死亡率仍约 70%，且约 90% 的复发由原始菌株引起，治疗费用高昂。目前尚无成功用于临床测试的隐球菌疫苗，开发有效疫苗迫在眉睫。
mRNA 疫苗技术因重大科技突破和基础设施建立，已成为临床证实有效的疫苗技术。本文旨在构建编码已知隐球菌抗原的 mRNA-LNPs，并在小鼠隐球菌病模型中验证其保护作用。
二、mRNA-LNPs 的组装与验证
制作 mRNA 的流程包括合成密码子优化的隐球菌抗原基因、PCR 扩增转录模板线性 DNA、体外转录修饰的聚腺苷酸化 mRNA。制备 mRNA-LNPs 时，将 mRNA 溶液与含可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和 PEG 脂质的混合物快速混合，经透析转化为稳定的 mRNA-LNPs。
实验测试包装小酵母 tRNA 或酵母总 RNA，封装效率达 80 - 95%；制备的 mCherry-LNPs 包装效率为 84 - 97%，中位直径约 155nm。与巨噬细胞孵育实验表明，裸 mCherry RNA 转染细胞无明显荧光信号，而 mCherry-LNPs 转染后超 90% 巨噬细胞呈现红色荧光；肌肉注射 mCherry-LNPs 的小鼠，注射部位大腿组织约 10% 视野出现强红色荧光细胞团，证实 mRNA-LNPs 可被细胞摄取，且 mRNA 能在体内外释放并翻译。
三、5’非翻译区（UTR）优化增强蛋白质表达
为降低疫苗成本，测试含 6 种 5’ UTR 的 mCherry 构建体。结果显示，使用 ALB3、HBA1 和 Moderna 5’ UTR 的 mCherry-LNPs 在巨噬细胞中的荧光水平与原始 ACTB 5’ UTR 相似，而使用 HBB 和 BioNTech 5’ UTR 的 mCherry-LNPs 荧光强度提高 4 倍。选择 BioNTech 的 5’ UTR 进行后续实验，注射含该 5’ UTR 的 mCherry-LNPs 后，小鼠注射部位相邻脂肪细胞和肌肉细胞中 mCherry 表达更高且更均匀。
四、CDA1 mRNA-LNPs 联合胶囊对隐球菌病的强保护作用
基于 RNA-seq 数据分析及亚单位蛋白疫苗的保护效果，选择 Cda1 和 Blp4 构建 mRNA-LNPs。制备的 BLP4-LNPs 和 CDA1-LNPs 包装效率为 84 - 97%。免疫 BALB/c 小鼠后，通过 western blot 检测发现，每次接种 2 周后血清中含 mCherry/Cda1 特异性抗体，且首次和第二次加强免疫后抗体水平显著增加。
用强毒临床分离株 H99 鼻内攻击免疫小鼠，观察 40 天。结果显示，mCherry-LNPs 和 BLP4-LNPs 免疫的小鼠均在感染后 26 天内达到临床终点，CDA1-LNPs 免疫小鼠中位生存期稍有延长，但差异无统计学意义。
考虑到小鼠背景和接种间隔可能影响疫苗效果，在 CBA/J 小鼠中以 3 周间隔测试 mRNA-LNPs，结果类似。因多糖提取物可作真菌疫苗佐剂，且隐球菌胶囊主要由糖醛酸木甘露聚糖和半乳糖木甘露聚糖组成，免疫原性弱，故测试 mRNA-LNP 疫苗与纯化胶囊联合使用效果。结果显示，CDA1-LNPs 联合胶囊免疫的小鼠 80% 存活至研究结束，且肺真菌负荷显著低于对照组，表明 CDA1-LNPs 联合胶囊佐剂对致命隐球菌感染有强保护作用。
mRNA 疫苗中的抗原与亚单位蛋白疫苗中的抗原作用机制可能不同。mRNA 疫苗可表达完整膜锚定蛋白及可能的翻译后修饰，类似天然真核病原体蛋白，如全长 GPI 锚定蛋白 Pvs25 作为 mRNA 疫苗的效果优于截短版本。同时，mRNA 疫苗在宿主内翻译可避免抗原蛋白纯化的问题。
虽然 CDA1-LNPs 联合胶囊佐剂效果显著，但尚不清楚是胶囊多糖、残留蛋白还是两者共同增强了保护作用。此外，使用 mRNA-LNP 疫苗对抗真菌疾病仍面临诸多挑战，如保护免疫缺陷个体等。未来需在免疫缺陷动物模型中测试最强抗原和合适佐剂的 mRNA-LNP 疫苗，也可尝试采用编码细胞因子的遗传佐剂策略。
五、研究方法
- 设计与合成编码候选隐球菌免疫原或 mCherry 报告基因的 mRNA：优化编码序列，合成相关质粒，经 PCR 扩增、转录、纯化获得 mRNA。
- 将 N1ψmRNA 包装到 LNPs 中：参考 Moderna 新冠疫苗，确定脂质组合，采用微流控混合技术制备 mRNA-LNPs。
- 表征 RNA-LNPs 包装：通过比较裂解和未裂解 LNPs 的 RiboGreen 荧光信号定量 mRNA 包装效率。
- 纳米颗粒尺寸表征：运用 NanoFCM Flow Nanoanalyzer 和电子显微镜两种方法测定 LNPs 尺寸分布。
- 评估 mCherry mRNA-LNPs 的体外和体内活性：进行细胞转染和动物注射实验，观察荧光细胞。
- 重组蛋白纯化：转化质粒诱导表达，经离心、亲和层析纯化蛋白。
- 蛋白质免疫印迹（Western Blot）：分离、转移蛋白，与免疫小鼠血清孵育，用二抗显色成像。
- 胶囊纯化：培养隐球菌，用 DMSO 提取、透析、冻干获得纯化胶囊。
- 小鼠模型中抗隐球菌病疫苗接种：多次免疫小鼠，用 H99 感染，监测疾病进展，统计动物生存情况。
