突破技术壁垒：细胞内 NMR 揭示蛋白质在不同细胞周期及 3D 组织模型中的奥秘

目前多数蛋白质研究基于体外实验，无法反映其在细胞内真实状态。研究人员开展利用细胞内 NMR（in - cell NMR）研究蛋白质结构和相互作用的主题研究。结果表明该方法可用于特定细胞周期及 3D 组织模型研究，为探究蛋白质行为提供新视角。

　　在生命科学领域，蛋白质就像一个个神秘的 “小工匠”，在细胞这个微观工厂里各司其职，对维持生命活动起着关键作用。长久以来，科研人员想要了解这些 “小工匠” 的工作方式，大多是在体外 “模拟工厂” 中进行研究，也就是将纯化后的蛋白质放在稀释的缓冲溶液里做实验。在这个 “模拟工厂” 里，蛋白质的活动很容易受到周围环境因素，像酸碱度（pH）、离子强度、分子拥挤程度等的影响。这些环境因素一旦有变化，蛋白质的结构、稳定性和动态变化也会跟着变，进而影响它们的功能。

然而，真实的细胞环境可比这个 “模拟工厂” 复杂多了。细胞内部十分拥挤，成分也极为复杂，就像一个热闹又忙碌的大集市。在这样的环境里，蛋白质的功能执行方式和在体外 “模拟工厂” 里可能大不相同。所以，想要真正搞清楚蛋白质在活细胞里的工作原理，就必须深入这个 “大集市” 去研究它们。

为了攻克这个难题，来自中欧技术研究所（Central European Institute of Technology）等多个研究机构的科研人员踏上了探索之旅。他们把目光聚焦在细胞内核磁共振光谱技术（in - cell NMR spectroscopy）上，希望借助它来揭开蛋白质在细胞内的神秘面纱。经过一系列艰苦的研究，他们成功找到了一种新方法，能够利用 in - cell NMR 在活的人类细胞中，对处于特定细胞周期阶段的蛋白质结构和相互作用进行原子分辨率的分析，还能在 3D 人体组织模型中开展相关研究。这一重大发现意义非凡，就像是为科研人员打开了一扇全新的大门，让他们能够从不同角度去探究蛋白质在各种生理情况下的行为，比如细胞周期变化时，蛋白质结构会如何改变，药物又是怎样与蛋白质 “交流” 并发挥作用的。这项研究成果发表在了《Communications Biology》上。

研究人员为开展这项研究，用到了几个关键的技术方法。首先是构建稳定转染细胞系，他们将感兴趣的基因插入到特定载体，再转染到细胞中，获得稳定表达目标蛋白的细胞系。其次是细胞同步化技术，通过使用诸如含羞草碱（mimosine）、RO3306 和诺考达唑（nocodazole）等物质，让细胞停留在特定的细胞周期阶段（G₁/S 和 G₂/M 期）。最后，利用 NMR 生物反应器和 in - cell NMR 光谱技术，对细胞或细胞形成的球体进行检测和分析。

下面我们来看看具体的研究结果：

• 稳定转染细胞系构建及蛋白表达验证：研究人员最初尝试用 PiggyBac Cumate Switch Inducible Vector 来调控蛋白表达，但效果不太理想。随后他们对载体进行改造，把 cumate operator 和 repressor 换成 tetracycline operator（TetO）和 repressor（TetRep;TR），并将改造后的载体整合到稳定表达四环素阻遏蛋白的细胞系中。经过一系列筛选和优化，获得了稳定转染且蛋白表达更均匀的单克隆细胞系，成功验证了该策略可用于获取 in - cell NMR 数据。
• 细胞周期同步化下的 in - cell NMR 研究：以碳酸酐酶 II（CAII）为研究对象，研究人员在细胞周期同步化的细胞中诱导蛋白过表达。结果发现，在 G₁/S 和 G₂/M 期同步化的细胞中，CAII 的 in - cell NMR 光谱呈现出预期信号，加入其抑制剂甲醋唑胺（MZA）后，光谱模式发生变化，这表明 in - cell NMR 能够评估不同细胞周期阶段蛋白质的结构以及与药物分子的相互作用。
• 3D 细胞培养模型中的 in - cell NMR 应用：研究人员利用稳定转染细胞系形成球体，构建 3D 人体组织模型。结果显示，从这些球体样本获得的 NMR 光谱与单细胞悬浮液的光谱相比，信噪比和分辨率相当。在含有 CAII 的球体模型中加入 MZA，光谱模式改变，证实了可以在 3D 组织培养系统中进行基于 in - cell NMR 的药物筛选。而且，在构建的包含不同细胞类型的混合 3D 培养模型中，同样证明了这种药物筛选方法的可行性。

在研究结论和讨论部分，研究人员通过改造 PiggyBac 转座子系统，成功实现了对目标蛋白过表达的精准控制，在单细胞水平上获取了蛋白质在细胞周期不同阶段和 3D 细胞培养中的原子分辨率信息。不过，研究中目标蛋白的细胞内浓度虽然高于内源性蛋白水平，但仍低于一些传统方法（如瞬时转染）所能达到的浓度，这在一定程度上限制了对蛋白质结构的确定。同时，该方法目前也存在细胞类型的局限性，主要适用于 HEK293 细胞及少数其他细胞类型。尽管如此，与其他方法相比，这种稳定转染的方法也有独特优势，比如能够研究在细胞内原位产生、折叠和成熟的蛋白质，并且不会对细胞膜造成损伤，更有利于维持细胞周期的同步性。未来，随着 NMR 技术的进一步发展，如更高磁场强度的光谱仪出现，以及同位素标记技术的改进，有望进一步提高检测灵敏度，拓展该方法在复杂人体组织模型研究中的应用，为生命科学和健康医学领域带来更多突破，帮助我们更好地理解蛋白质的奥秘，为疾病治疗和药物研发提供更坚实的理论基础。