多组学解析人类 RAG 缺陷：免疫失调模式与炎症特征的深度洞察

本文通过多组学方法研究 157 例 RAG（重组激活基因）缺陷患者，发现不同表型患者存在免疫失调的共同与独特特征，如 Omenn 综合征（OS）有 TH2 细胞偏移和炎症特征，更轻微的 RAG 缺陷与 1 型免疫相关。这些发现有助于改善疾病诊断和临床管理。

　　

引言

重组激活基因（RAG）编码的 RAG1 和 RAG2 蛋白在 V (D) J 重组过程中发挥关键作用，这一过程对于成熟 T 细胞和 B 细胞的发育以及有效的适应性免疫应答至关重要。RAG1 或 RAG2 基因的双等位基因功能丧失突变，会致使 T 细胞和 B 细胞发育早期停滞，进而引发 T^?B^?严重联合免疫缺陷病（SCID） 。而 RAG 基因的低表达变异则与一系列表型相关，包括 Omenn 综合征（OS）、渗漏型 SCID（LS）以及迟发性联合免疫缺陷（CID）。这些表型各具独特特征，例如 OS 表现为早发性全身性皮疹、嗜酸性粒细胞增多、免疫球蛋白 E（IgE）升高，以及自体寡克隆 T 细胞浸润皮肤和多种器官；LS 常在幼儿期被诊断出，伴有自身免疫性血细胞减少和 γδ T 细胞受体（TCRγδ）T 细胞增多；CID 通常在生命后期被诊断，常伴有肉芽肿和自身免疫现象。

此前研究表明，RAG 缺陷表型的范围与突变 RAG 等位基因的重组活性相关，但这种关联无法为不同表型相关的免疫病理特征提供机制性见解。因此，本研究运用多组学方法，对 157 例涵盖疾病全谱的 RAG 缺陷患者的免疫病理进行深入表征。

结果

1. RAG 突变患者的临床和免疫表型：所有患者组都有感染病史，且频率相似。皮疹和肉芽肿分别是 OS 和 CID 的典型症状，而血细胞减少和其他自身免疫表现几乎仅在 CID 和 LS 患者中出现。SCID 患者存在严重的 T 细胞淋巴细胞减少；OS 患者中幼稚 CD45RA⁺CD4 T 细胞比例显著降低，而 LS 和 CID 患者中该比例部分保留。循环 B 细胞在 SCID 和 OS 患者中显著减少或缺失，在 LS 和 CID 患者中虽存在但水平低于正常。此外，所有患者组的自然杀伤（NK）细胞数量均正常。
2. RAG 突变等位基因的功能活性：在 157 例患者中，121 例（77.1%）携带双等位基因 RAG1 变异，36 例（22.9%）携带 RAG2 变异。研究鉴定出 98 种不同的 RAG1 变异和 32 种 RAG2 变异，并通过体外重组试验评估了其中 119 种变异的功能活性。结果显示，CID 和 LS 患者携带的 RAG 变异具有残留重组活性，而 OS 和 SCID 患者携带的变异功能几乎丧失。
3. RAG 突变患者 T 细胞和 B 细胞发育的特征：通过在人工胸腺类器官（ATO）系统中研究 13 例 RAG 突变患者的 CD34⁺细胞体外 T 细胞分化，发现无论临床表型的严重程度如何，人类 RAG 缺陷都允许 CD4⁺CD8⁺双阳性（DP）细胞的发育，但会损害 CD3⁺TCRαβ⁺（或 TCRγδ⁺）细胞的生成。同时，低表达 RAG 变异会影响 TRA 位点的顺序重排，导致涉及 5′TRAV 和 3′TRAJ 基因的重排频率降低。在 B 细胞发育方面，分析 18 例 RAG 突变患者和 5 例健康供体的骨髓抽吸物发现，大多数患者的 B 细胞发育在 pro-B 和 pre-B I 阶段存在早期阻滞，但 CID 和 LS 患者的这一缺陷存在一定程度的 “渗漏”，表现为有残留的未成熟 B 细胞发育和成熟 / 循环 B 细胞积累。
4. OS 和 CID 患者的皮肤和全身炎症特征：皮肤表现伴 T 细胞浸润是 RAG 相关 OS 和 CID 的标志。对患者皮肤活检分析发现，OS 和 CID 患者（伴有肉芽肿）的皮肤活检中存在 CD4 和 CD8 T 细胞浸润，以及 IFNG、CXCL9 和 CXCL10 转录本的表达。不过，CID 患者肉芽肿病变中存在显著的 1 型特征，而 OS 患者皮肤浸润中则大量表达 T 辅助 2（T_H2）细胞特异性转录因子 GATA 结合因子 3（GATA3），同时 T-bet 表达相对有限。此外，OS 患者存在嗜酸性粒细胞增多和血清 IgE 升高，且循环中 CD162⁺记忆 T 细胞频率增加，T_H2 细胞、T 滤泡辅助（T_FH）2 细胞和 2 型固有淋巴细胞（ILC2s）比例也明显升高，呈现出明显的全身 “2 型” 表型。
5. RAG 突变患者的广泛炎症特征：对 RAG 突变患者和健康供体血浆中 33 种可溶性生物标志物的浓度进行量化分析，发现 RAG 突变患者中大量生物标志物水平显著升高，其中 OS 患者的全身炎症特征最为明显，涉及多种免疫相关的生物标志物。通过 SomaScan 进行的蛋白质组学分析显示，所有 RAG 突变患者组都存在 IFN-γ 和巨噬细胞激活相关的促炎特征，同时不同患者组也有各自独特的蛋白质表达特征。
6. RAG 突变患者血浆中检测到多种自身抗体：对 10 例 RAG 突变患者（4 例 CID、3 例 LS 和 3 例 OS）和 10 例健康供体的血浆进行 HuProt 微阵列分析，发现 RAG 突变患者对多种自身抗原的反应性增强。进一步分析更大群体的 RAG 突变患者发现，CID 和 LS 患者中大多存在针对 I 型干扰素（IFN-α、IFN-β 和 IFN-ω）的自身抗体，且多数具有中和活性，此外还检测到少量针对 IFN-λ 和其他细胞因子的自身抗体，而 OS 和 SCID 患者中则较少检测到这些自身抗体。
7. CID 和 LS 患者外周血中功能失调 B 细胞富集：分析 CID 和 LS 患者的外周 B 细胞区室，发现与健康供体相比，这些患者的 IgD⁺CD27^?幼稚 B 细胞比例较低，而 IgD^?CD27^?、未转换记忆（IgD⁺CD27⁺）和转换记忆（IgD^?CD27⁺）B 细胞频率略有增加。同时，CID 和 LS 患者中 CD19^hiCD21^lo B 细胞频率增加，且该细胞与 CXCL9 水平和 T_FH1 细胞比例相关。此外，患者体内还存在多种亚型的非典型 B 细胞，且 9G4⁺ B 细胞比例较高，这表明 CID 和 LS 患者外周 B 细胞区室中存在功能失调的 B 细胞。
8. RAG 突变杂合携带者和其他形式 LS 患者的免疫失调特征：研究发现，RAG 突变杂合携带者的血浆中 CXCL9、CXCL10、IL-1β 和 CCL4 水平升高，部分个体的 9G4⁺和 9G4^int B 细胞比例增加，且存在低水平的抗 I 型干扰素抗体，但这些抗体无中和活性。对 16 例其他适应性免疫缺陷患者的样本分析表明，炎症特征并非 RAG 突变患者所特有，在其他影响适应性免疫的遗传缺陷患者中也可观察到。
9. 单细胞分析揭示 RAG 突变患者炎症和免疫失调的表型特异性特征：对 11 例 RAG 突变患者（3 例 CID、3 例 OS、3 例 SCID 和 2 例 LS）和 7 例健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）进行单细胞转录组和表位细胞索引测序（CITE-seq）分析，鉴定出 5 种主要的免疫细胞亚群。Hallmark 通路分析显示，所有 RAG 突变患者组的多种 PBMC 类型中都存在以 TNF-α、IFN-γ 和 IFN-α 反应为主的显著炎症特征，同时还涉及多种免疫激活相关通路。进一步对各免疫细胞亚群的分析揭示了不同患者组的特异性特征，例如 CID 组多种免疫细胞亚群呈现 1 型免疫病理特征，OS 组则以 2 型免疫病理特征为主，这些结果有助于深入理解不同表型的免疫失调机制。

讨论

本研究利用多组学方法全面表征了人类 RAG 缺陷的分子和免疫学特征，明确了与不同临床表型相关的共同和独特特征。研究再次证实，CID 和 LS 表型与突变等位基因的残留功能活性相关，且人类 RAG 变异在体外允许 DP T 细胞发育，这与小鼠模型中的情况有所不同。在骨髓中，RAG 突变患者的 B 细胞发育在 pro-B/pre-B I 阶段存在阻滞，但 LS 和 CID 患者存在一定程度的 “渗漏” 。

此外，研究还发现 RAG 缺陷与 TRA 位点重排模式的改变有关，杂合 RAG 变异个体的 Vα7.2⁺ T 细胞比例介于健康供体和 RAG 突变患者之间。在免疫失调方面，OS 患者表现出强烈的全身和皮肤 2 型特征，而 CID 患者则具有明显的 1 型炎症特征。这些炎症特征可能与反复和 / 或持续感染有关，在治疗过程中使用抗炎药物时，需要权衡其潜在益处与感染风险的增加。

同时，自身免疫也是 RAG 缺陷患者免疫失调的重要特征，CID 和 LS 患者外周 B 细胞区室中功能失调的 B 细胞比例增加，产生多种自身抗体，其中抗 I 型干扰素抗体与严重或慢性病毒感染风险相关。然而，本研究存在一定局限性，如部分检测仅在部分患者亚组中进行，缺乏对患者免疫状态的纵向评估，且免疫调节治疗可能影响研究结果。尽管如此，本研究仍成功表征了人类 RAG 缺陷的全身和组织特异性炎症及免疫失调特征，为后续设计针对不同表型的药物干预措施提供了重要依据。

材料和方法

1. 研究设计：旨在通过多组学方法研究人类 RAG 缺陷表型异质性的免疫学和分子相关性。
2. 患者：研究纳入了 157 例双等位基因 RAG 突变患者，涵盖疾病的所有表型；40 例携带杂合有害 RAG 变异的健康个体；16 例由其他基因缺陷导致 SCID/LS/CID 的患者；以及 135 例年龄匹配的健康供体。所有样本均在获得书面知情同意后采集，遵循相关研究方案并经批准。
3. 突变 RAG 等位基因的重组活性检测：采用基于流式细胞术的报告试验检测突变 RAG1 和 RAG2 等位基因的重组活性，并通过 Kruskal-Wallis 检验进行统计分析。
4. 免疫表型分析、体外 T 细胞分化研究、可溶性生物标志物检测、蛋白质组学分析、自身抗体和抗细胞因子抗体检测：对多种免疫细胞亚群进行鉴定和分析，评估骨髓中 B 细胞的成熟情况，在 ATO 系统中研究体外 T 细胞分化，采用多种方法检测血浆中可溶性生物标志物、蛋白质组学分析、自身抗体和抗细胞因子抗体。
5. 组织免疫病理学分析：对 OS 患者和 CID 伴肉芽肿病变患者的皮肤活检进行常规免疫组织化学和 RNAscope 分析，检测相关蛋白和基因的表达。
6. 单细胞 CITE-seq 处理、测序和聚类分析：对 11 例 RAG 突变患者和 7 例健康供体的冷冻 PBMC 样本进行处理、测序和分析，包括数据处理、质量控制、聚类分析和基因集富集分析等步骤。
7. TCR 和 BCR 数据处理：使用 CellRanger 创建 V (D) J contigs，并对 TCR 和 BCR 序列数据进行后续分析。
8. 统计分析：根据不同的比较目的，采用 Mann-Whitney U 检验、Kruskal-Wallis H 检验、混合效应模型等进行统计分析，并使用 PRISM 软件生成数据图。

致谢

研究团队对众多参与研究的个人和机构表示感谢，包括生物信息学团队、测序项目团队以及参与研究的志愿者和家庭。同时，研究得到了多个机构和基金的资助，众多作者在研究的不同阶段发挥了重要作用。此外，部分作者存在潜在的利益冲突，研究数据和代码已公开可获取。