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在工业酶生产中，核糖体暂停影响蛋白质合成效率。研究人员针对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生产 α- 淀粉酶 AmyM 过程开展核糖体暂停研究。发现 amyM 基因存在多个核糖体暂停位点，且不受营养变化影响。这为优化淀粉酶生产提供了新信息。
在工业酶生产的宏大舞台上，微生物扮演着至关重要的角色，尤其是枯草芽孢杆菌（
Bacillus subtilis），凭借其强大的酶分泌能力，成为生产 α- 淀粉酶 AmyM 的得力 “干将”。α- 淀粉酶 AmyM 能水解淀粉内部的 α-1,4 糖苷键，在酿造、烘焙、纺织以及洗涤剂配方等众多工业领域都有广泛应用 。
然而，在这场微生物 “生产秀” 中，核糖体暂停这一现象却如同隐藏在幕后的 “神秘角色”，严重影响着蛋白质的合成效率。核糖体的翻译过程本应是一场有序的 “接力赛”，但暂停现象的出现，却使得这一过程时而受阻。以往的研究发现，核糖体暂停与多种因素有关，比如密码子的使用情况、氨基酸的可获取性、氨基酸序列以及 mRNA 的结构等。人们普遍认为，稀有密码子会导致核糖体暂停，进而影响异源蛋白的表达。可奇怪的是，在很多情况下，即便对密码子进行了优化，蛋白质的表达却并没有得到明显改善。这就好比精心调整了比赛规则，选手们却依旧没有取得更好的成绩，背后的原因着实令人费解。
为了揭开这层神秘的面纱，来自荷兰阿姆斯特丹大学斯瓦默丹生命科学研究所（Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam）和德国巴斯夫公司白色生物技术研究中心（White Biotechnology Research, BASF SE）的研究人员携手合作，开启了一场深入探究之旅。他们聚焦于枯草芽孢杆菌生产 α- 淀粉酶 AmyM 过程中核糖体暂停现象，试图找出其中的关键奥秘。这项研究成果发表在了《Microbial Cell Factories》杂志上，为该领域的发展注入了新的活力。
在这场科研探索中，研究人员运用了多种关键技术。其中，核糖体分析（ribosome profiling）技术是重中之重，它就像是一台 “显微镜”，能够帮助研究人员在基因组水平上精准定位核糖体暂停位点。在操作过程中，研究人员先收集细胞样本，通过一系列复杂的处理，包括细胞裂解、核酸酶消化等步骤，获得核糖体保护片段（RPFs），随后对这些片段进行测序分析 。此外，他们还利用生物信息学工具对数据进行处理和分析，像是用 Cutadapt 工具去除 3’端接头序列，使用 Bowtie2 工具将序列比对到枯草芽孢杆菌的基因组上 。同时，为了验证实验的准确性，他们还进行了淀粉酶活性检测等实验。
下面来看看具体的研究结果：
- 评估核糖体停滞：研究人员利用莫匹罗星（mupirocin）这一特殊的 “工具” 来评估核糖体分析流程的质量。莫匹罗星能抑制异亮氨酰 - tRNA 合成酶，使核糖体在异亮氨酸密码子处停滞。实验结果显示，从核糖体保护片段 3’端减去 12nt 来确定核糖体 A 位点密码子位置最为准确。这就好比为研究人员找到了一把精准的 “尺子”，能够更精确地测量核糖体的 “活动轨迹”。
- 翻译起始位点的不同保护：经过验证实验流程后，研究人员对生长 16h 后的样本进行标准核糖体分析。他们发现，amyM 基因存在 12 个明显的核糖体暂停峰，其中最强的两个暂停位点位于 ATG 起始密码子上游，这表明核糖体与 Shine Dalgarno 序列结合紧密。而且，通过对基因组范围的分析发现，从 5’端计数时，翻译起始峰的分布更窄，这可能是由于核糖体从起始复合物转变为翻译核糖体时构象发生了变化。这一发现就像是发现了核糖体在翻译起始阶段的 “特殊偏好”，为后续研究提供了重要线索。
- 核糖体暂停位点的密码子基序：amyM 基因中核糖体暂停位点的存在引发了研究人员的思考，究竟是什么原因导致了翻译暂停呢？他们经过研究发现，这些暂停位点既与连续的脯氨酸密码子无关，也与稀有密码子没有关联。相反，在核糖体暂停位点，天冬氨酸和谷氨酸密码子的出现频率略有增加，这或许暗示着在取样时培养基中这些氨基酸的水平相对较低。这一结果打破了以往人们对核糖体暂停原因的固有认知，为进一步研究指明了方向。
- 暂停位点与蛋白质二级结构的相关性：通常认为核糖体暂停可能有助于蛋白质结构域的折叠，所以研究人员推测核糖体暂停位点可能与蛋白质的二级结构存在某种联系。然而，通过研究发现，虽然有些核糖体暂停峰似乎靠近 AmyM 中假定的 α 螺旋或 β 折叠，但二者之间的相关性在统计学上并不显著。这表明，不能仅仅依据蛋白质的基本二级结构来推断核糖体暂停与蛋白质折叠之间的关系，这也让研究人员意识到核糖体暂停现象的复杂性。
- 发酵过程中密码子占据稳定性：在细胞培养 64h 后，细胞的光密度不再增加，淀粉酶的产量也达到了峰值。但此时对 amyM 基因进行核糖体分析发现，其 mRNA 仍然存在明显的核糖体暂停位点，并且许多暂停峰与 16h 样本中的相同，只是新增了几个峰。这说明在发酵后期，amyM 基因的翻译活动依旧活跃，核糖体暂停位点在发酵过程中具有一定的稳定性。
- 核糖体占据与 mRNA 水平的相关性：研究人员还发现，在 64h 时，amyM 基因虽然仍有明显的核糖体暂停位点，表明其在积极翻译，但培养基中淀粉酶的含量却不再增加。通过对所有基因的分析发现，核糖体占据与 mRNA 水平之间存在很强的相关性，而且 64h 时 mRNA 水平明显低于 16h，这说明 64h 后淀粉酶产量不再增加的原因是转录水平较低，而非细胞翻译能力下降。这一结论就像是解开了发酵后期淀粉酶产量之谜的一把钥匙，让人们对整个生产过程有了更深入的理解。
- 其他基因中的强翻译暂停：研究人员还对基因组中翻译水平较高的基因进行了研究，发现编码小分泌抗菌肽的 epeX、sdpC 和 skfA 基因存在很强的核糖体暂停位点。他们推测这些可能是核糖体停滞位点，能够防止毒素在未与分泌系统对接时就完全合成。此外，研究人员构建了缺失这三个基因的菌株，发现 AmyM 的产量并未增加，这表明这些基因的高核糖体占据并不会对翻译机制造成负担。这一发现为研究核糖体与基因表达之间的关系提供了新的视角。
在研究结论和讨论部分，研究人员通过核糖体分析技术，深入了解了枯草芽孢杆菌在重复分批发酵过程中的翻译活动。他们发现即使在发酵 64h 后，许多基因仍在进行翻译，包括 amyM 基因 。而且，这些核糖体暂停位点无法根据核苷酸或氨基酸序列进行预测，这意味着 mRNA 结构可能在核糖体暂停中起着关键作用 。虽然目前还未明确同义密码子的改变是否能去除这些暂停位点，以及这是否会提高整体表达水平，但这些暂停位点的存在为今后进行密码子优化研究提供了重要的参考信息，因为它们可能对蛋白质的高效折叠至关重要。这项研究为优化枯草芽孢杆菌生产 α- 淀粉酶的工艺提供了新的理论依据，有望在未来的工业酶生产中发挥重要作用，提高生产效率，降低生产成本，推动相关产业的发展。
