一种肿瘤分泌蛋白利用胰高血糖素的释放引起宿主消瘦

　　

肿瘤诱发机体消瘦机制新发现：肿瘤分泌蛋白通过促进胰高血糖素释放引发全身性消耗

近期，来自武汉大学中南医院肝胆胰外科、免疫学与代谢前沿科学中心等单位的研究人员，在《Cell Discovery》期刊上发表了题为 “A tumor-secreted protein utilizes glucagon release to cause host wasting” 的研究论文。该研究首次揭示了肿瘤利用宿主关键分解代谢激素导致全身性消瘦的机制，为肿瘤恶病质的治疗提供了潜在的新靶点和理论依据，在肿瘤研究领域具有重要意义。

一、研究背景

肿瘤恶病质，即肿瘤诱导的宿主消瘦，是一种严重的代谢紊乱疾病，其特征包括体重下降、肌肉和脂肪组织减少以及高血糖等。与单纯的营养不良不同，癌症恶病质难以通过营养补充来逆转。以往研究表明，肿瘤可分泌多种因子直接作用于肌肉或脂肪组织，影响局部能量稳态，进而导致肌肉萎缩或脂质流失。然而，恶性肿瘤是否以及如何劫持宿主的关键分解代谢激素，广泛破坏多个器官的代谢稳态并导致全身性消瘦，这一问题仍未得到充分解答。

在果蝇中，Akh 是人类胰高血糖素的同源物，在调节全身能量储存方面发挥着重要作用。Akh 由神经内分泌细胞产生，可激活其受体 AkhR，进而调控全身脂质、碳水化合物和氨基酸代谢。已有研究指出，Akh 的释放受多种因素调节，包括远端器官分泌的蛋白质以及上游神经元释放的神经递质或神经肽等。但肿瘤与 Akh 释放之间的关系尚未明确。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

1. 果蝇品系：研究使用了多种果蝇品系，包括从 Bloomington Drosophila Stock Center、Vienna Drosophila Resource Center 等获取的 UAS - Timp、Pvr - GAL4、Cha - GAL4 等品系，以及实验室先前构建的 esg - GAL4、tub - GAL80TS 等品系。

2. 小鼠品系与细胞系：实验选用 C57BL/6、ApcMin/+、Gcg -/- 等小鼠品系，以及 αTC1 细胞系。其中，ApcMin/+ 小鼠是常用的结肠癌模型，会出现体重下降、脂肪和肌肉萎缩等症状；Gcg -/- 小鼠则用于研究胰高血糖素缺失对肿瘤诱导消瘦的影响。

3. 患者样本：收集了胰腺癌患者和胰腺良性疾病患者的外周血样本，用于检测血浆中胰高血糖素的浓度。

（二）实验方法

1. 果蝇实验
   

• 诱导肠道肿瘤：通过特定的杂交组合和温度控制，诱导果蝇肠道肿瘤的产生。例如，将不同的 UAS 和 LexAop 插入品系分别与 esg - GAL4、tub - GAL80TS 等品系杂交，在 18°C 抑制 GAL4/LexA 活性，4 日龄处女成虫转移至 29°C 以诱导转基因表达，从而产生肠道肿瘤。

• 体内 RNAi 筛选：将不同的 RNAi 品系与 Akh - GAL4 品系杂交，对果蝇幼虫 APCs 中的跨膜蛋白进行体内 RNAi 筛选，通过测量血糖变化（循环海藻糖 TRE 水平）来评估 Akh 释放的调节情况。

• 代谢和生化测量：对果蝇的脂质和碳水化合物进行测量，包括甘油三酯（TAG）和海藻糖（TRE）水平。通过匀浆、离心等操作处理果蝇样本，利用特定试剂盒和试剂进行检测，并将结果标准化到蛋白质水平。同时，采用点杂交分析检测果蝇血淋巴中 Akh 的含量。

• 行为学实验：进行攀爬、食物摄入和饥饿实验。通过拍摄果蝇攀爬过程，利用 ImageJ 软件量化攀爬高度和速度；通过测量果蝇摄入含染料食物后体内染料浓度，评估食物摄入量；在饥饿实验中，统计不同时间点死亡果蝇的数量。

2. 小鼠实验
   

• 动物模型构建与处理：构建 ApcMin/+ 小鼠结肠癌模型和 Lewis Lung Carcinoma（LLC）小鼠肺癌恶病质模型。对肿瘤小鼠进行分组，分别给予不同的抑制剂处理，如 Axitinib、Regorafenib、GRA - Ex - 25、LGD - 6972 等，同时设置对照组给予生理盐水或载体处理。

• 样本检测：对小鼠血清中的胰高血糖素浓度进行测量，采用 ELISA 试剂盒按照操作说明进行检测。进行葡萄糖耐量试验（GTT），测量小鼠空腹 16 小时后注射葡萄糖后的血糖变化；使用握力计测量小鼠前肢握力；对小鼠的组织进行解剖、称重和固定，用于后续的组织学分析和基因表达检测。

3. 细胞实验：将 αTC1 细胞在特定培养基中培养，添加 PDGF - BB 刺激 3 小时后，收集细胞进行 RNA 提取，用于检测相关基因的表达变化。

4. 其他实验技术：运用免疫染色和电子显微镜技术对果蝇和小鼠的组织样本进行处理和观察；提取果蝇和小鼠组织以及细胞的 RNA，进行逆转录和 qPCR 反应，检测目的基因的表达水平；对果蝇的 RNA 进行测序分析，筛选差异表达基因，并进行功能富集分析。

（三）关键技术路线

1. 利用果蝇 yki3SA - 肿瘤模型，检测肿瘤小鼠 APCs 中 Akh 的产生情况，通过构建 Akh 基因敲除果蝇模型，研究 Akh 在肿瘤诱导器官消瘦中的作用。

2. 采用体内 RNAi 筛选技术，鉴定调节 APCs 中 Akh 释放的受体，验证 Pvr 在 APCs 中的功能以及肿瘤分泌的 Pvf1 对 Pvr 的激活作用。

3. 通过基因操作和代谢分析，探究 Pvf1 - Pvr 轴促进 Akh 释放的分子机制，包括对 ERK/Mmp2 信号通路的影响以及对 ECM 重塑和神经元支配的调控。

4. 在哺乳动物模型中，检测肿瘤小鼠和胰腺癌患者的胰高血糖素水平变化，构建胰高血糖素基因敲除小鼠和使用胰高血糖素受体抑制剂处理肿瘤小鼠，验证胰高血糖素在肿瘤诱导消瘦中的作用。

5. 研究 PDGFR/VEGFR 信号通路在调节哺乳动物 α - 细胞与胆碱能神经元相互作用中的作用，通过给予 PDGFR/VEGFR 抑制剂，观察对肿瘤小鼠消瘦症状的改善情况。

三、研究结果

（一）Akh 是肿瘤诱导器官消瘦所必需的

研究人员发现，yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇的 APCs 质量、细胞内和循环 Akh 水平以及 Akh mRNA 水平均显著增加，同时 Akh 靶基因 tobi 的表达也上调。在 Akh 基因敲除的 yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇中，Akh 的缺失显著减轻了腹部肿胀、甘油三酯（TAG）损失和高血糖症状，同时恢复了被 yki3SA 肿瘤破坏的肌肉功能和卵巢稳态。RNA - seq 分析显示，yki3SA 肿瘤依赖 Akh 调节的基因显著富集于脂质和碳水化合物代谢、蛋白质稳态以及免疫反应相关的生物学过程、通路和细胞器中。此外，敲低脂肪体或泛神经元中 AkhR 的表达，至少部分挽救了肿瘤诱导的消瘦表型；然而，在非肿瘤对照果蝇中过表达 Akh 或 TrpA1，虽能增加 Akh 信号，但不足以导致器官消瘦。

（二）受体 Pvr 促进 APCs 中 Akh 的释放

通过对果蝇幼虫 APCs 中跨膜蛋白的体内 RNAi 筛选，研究人员发现敲低 Pvr 基因可显著降低血糖水平。进一步研究表明，Pvr 在幼虫和成年果蝇的 APCs 中均有表达，在成年果蝇 APCs 中过表达组成型激活的 Pvr（PvrAC）可增加 Akh 的产生、增强 Ca2?信号、扰乱碳水化合物 - 脂质代谢并降低饥饿条件下的存活率；相反，敲低或过表达 Pvr 的显性负形式（PvrDN）则产生相反的效果。在 yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇中，敲低 APCs 中的 Pvr 可显著降低 Akh 反应并改善宿主消瘦症状，而在肌肉或脂肪体中敲低 Pvr 对肿瘤诱导的消瘦改善作用不明显。

（三）肿瘤来源的 Pvf1 激活 APCs 中的 Pvr 以增强 Akh 释放

在 yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇中，特异性地在 APCs 中表达 PvrDN 或敲低 Pvr，可显著降低 Akh 反应并改善宿主消瘦症状，且不影响肿瘤生长。同时，Akh 基因敲除或肿瘤特异性敲低 Pvf1，均可有效减轻 yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇的消瘦症状，且 Akh 突变加肿瘤 Pvf1 敲低并未进一步显著缓解消瘦症状，表明肿瘤来源的 Pvf1 至少部分通过 Akh 导致宿主消瘦。

（四）Pvf1 - Pvr 轴通过 ERK/Mmp2 信号通路促进 Akh 释放

在 APCs 中过表达 PvrAC 的同时敲低 ERK，可显著提高果蝇在饥饿条件下的存活率，抑制 Akh 和 tobi 基因的表达，增加 TAG 水平并降低 TRE 水平；而过表达活性 Raf 激活 MEK/ERK 信号通路，则可模拟 Pvr 激活的效果，促进 Akh 释放并扰乱碳水化合物 - 脂质代谢稳态。RNAi 筛选发现，敲低 Mmp2 可有效挽救 PvrAC 相关的饥饿敏感性，抑制 Akh 释放，减少脂质损失和高血糖症状。在 yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇中，敲低 APCs 中的 ERK 或 Mmp2，可显著改善宿主消瘦症状，表明 Pvr - ERK - Mmp2 轴增强 Akh 释放，导致 yki3SA - 肿瘤果蝇的能量消耗。

（五）Pvf1 - Pvr 轴增强 Mmp2 依赖的 ECM 重塑和 APCs 的神经元支配

通过观察 GFP 标记的胶原蛋白 IV（Vkg - GFP）信号，研究发现 PvrAC 过表达可降低 APCs 周围的 Vkg - GFP 信号，而 Mmp2 RNAi 可恢复该信号；yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇中，Pvf1 敲低也可改变 APCs 的 ECM 重塑。同时，PvrAC 过表达可增加 APCs 中树突的数量，yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇的 APCs 树突数量也增加，表明 Pvf1 - Pvr - Mmp2 轴调节 ECM 并增加 yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇中 APCs 的神经支配。

（六）Pvf1 - Pvr 轴促进 APCs 的胆碱能神经支配以增加 Akh 释放

通过筛选不同神经递质产生神经元，研究人员发现胆碱能神经元与 APCs 存在功能性投射。在 yki3SA - 肿瘤荷瘤果蝇中，胆碱能神经元与 APCs 的接触显著增加；热激活胆碱能神经元可增强全身 Akh 反应，导致脂质损失和高血糖；而热破坏胆碱能神经元的神经传递，则可显著抑制 Akh 产生并减轻宿主消瘦症状。

（七）胰高血糖素是哺乳动物肿瘤诱导消瘦所必需的

研究人员测量了胰腺癌患者和肿瘤荷瘤小鼠的胰高血糖素水平，发现胰腺癌患者血清胰高血糖素浓度显著高于胰腺良性疾病患者，且肿瘤荷瘤小鼠（ApcMin/+ 和 LLC 荷瘤小鼠）也出现高胰高血糖素血症、α - 细胞增大等现象。在 ApcMin/+ 小鼠中使用胰高血糖素受体抑制剂 GRA - Ex - 25 或 LGD - 6972 处理，以及在 Gcg -/- 背景下构建 LLC 荷瘤小鼠模型，均显著减轻了肿瘤诱导的消瘦症状，包括体重下降、葡萄糖不耐受、肌肉和脂肪组织损失等。

（八）PDGFR/VEGFR 阻断减轻肿瘤荷瘤小鼠的胆碱能 - α - 细胞接触、胰高血糖素产生和消瘦

研究发现，肿瘤产生的 VEGF/PDGF 可激活 αTC1 细胞中的 PDGFR/VEGFR 信号，导致 Mmp 基因表达增加和 Timp 基因表达减少。在 ApcMin/+ 小鼠中，观察到 α - 细胞与胆碱能神经的接触增加，而给予 VEGFR/PDGFR 抑制剂 Axitinib 或 Regorafenib 处理后，可恢复 α - 细胞的 ECM 含量，减少胆碱能神经支配和 α - 细胞扩张，降低胰高血糖素水平，改善肿瘤诱导的消瘦症状，且不影响肿瘤生长。

四、研究结论与讨论

本研究揭示了肿瘤诱导宿主器官消瘦的新机制。在果蝇中，yki3SA 肿瘤通过分泌 Pvf1，激活 APCs 中的 Pvr 受体，进而通过 Pvr - ERK - Mmp2 轴促进 Akh 的释放。这一过程涉及 Mmp2 依赖的 ECM 重塑和 APCs 与上游胆碱能神经元的神经支配增强。在哺乳动物中，肿瘤同样通过类似机制促进胰高血糖素的释放，导致器官消瘦。阻断胰高血糖素或其相关受体（如 PDGFR，果蝇 Pvr 的同源物）的作用，可有效改善肿瘤诱导的器官消瘦症状。

该研究具有多方面的重要意义。首先，明确了肿瘤利用宿主关键分解代谢激素导致全身性消瘦的机制，为深入理解肿瘤恶病质的发病机制提供了新的视角。其次，发现的 Pvf1 - Pvr 轴以及相关信号通路，为开发治疗肿瘤恶病质的新型药物提供了潜在靶点。此外，研究还提示胰高血糖素在慢性疾病中的作用可能超出了其在短期高血糖调节中的已知功能，有望为相关代谢性疾病的研究和治疗带来新的思路。未来，进一步研究 Pvr 信号在其他组织中的作用，以及肿瘤相关恶病质因子刺激胰高血糖素产生的具体机制，将有助于更深入地了解肿瘤与宿主之间的相互作用，推动肿瘤治疗领域的发展。