基于聚酮合酶的生物合成平台：二醇、氨基醇和羟基酸生产的创新突破

美国加利福尼亚大学伯克利分校化学与生物分子工程系的 Qingyun Dan 等研究人员在Nature Catalysis期刊上发表了题为 “A polyketide-based biosynthetic platform for diols, amino alcohols and hydroxy acids” 的论文。该研究构建了基于聚酮合酶（PKS）和末端硫还原酶（TR）的生物合成平台，可高效生产二醇、氨基醇和羟基酸等多种化合物，为解决中长链和支链化合物生物合成难题提供了创新方案，在化工、材料和医药等领域具有广阔的应用前景。

研究背景

二醇、氨基醇和羟基酸在工业领域应用广泛。中长链和支链二醇是重要的工业溶剂、聚合物构建模块、化妆品和制药成分，如 2 - 乙基 - 1,3 - 己二醇（2-E-1,3-HDO）可用作驱虫剂、硼萃取剂、油墨溶剂和化妆品成分，其衍生物 2 - 乙基己醇是聚氯乙烯增塑剂的主要构建模块，市场规模庞大。然而，目前生物合成这些化合物面临诸多挑战。一方面，生产中长链和支链二醇的代谢途径稀少且尚未商业化，且每种目标分子通常需要独特的生物合成途径，难以将一种分子合成的知识扩展到其他分子。另一方面，传统聚酮合酶（PKS）在生物合成中存在局限性，多数天然 PKS 以硫酯酶（TE）终止聚酮生物合成，生成羧酸、内酯或内酰胺，无法直接得到目标产物，限制了 PKS 的设计空间。

模块化 I 型聚酮合酶（PKS）可利用辅酶 A（CoA）底物产生复杂天然产物，其产物化学结构由酶结构域和模块顺序严格决定，这为设计 PKS 生产特定有机分子提供了可能。此前研究已对 PKS 进行改造，使其具备新功能或生产新分子。同时，非核糖体肽合成酶（NRPSs）、羧酸还原酶（CARs）等系统中存在还原依赖性终止机制，受此启发，研究人员期望利用 PKS TR 开发新的生物合成平台。

研究材料和方法

实验材料

研究选用多种菌株，包括Streptomyces albus J1074、Streptomyces coelicolor M1152、E. coli ET12567/pUZ8002 等。使用多种质粒，如 pSC 和 p41 等整合载体、pOSV807 和 pOSV809 等Streptomyces整合载体以及 pHIS 和 pMBP 等E. coli表达载体。此外，还使用了多种化学试剂，如 1,3 - 戊二醇、2 - 乙基 - 3 - 羟基己酸等。

实验方法

质粒构建与整合：采用 Gibson 组装协议构建整合质粒，并通过三亲结合法导入Streptomyces albus J1074，双亲结合法导入Streptomyces coelicolor M1152 。
菌株培养：对整合成功的Streptomyces菌株进行培养，包括孢子收集、保存和不同培养基中的培养，用于后续实验。
产物检测与分析：运用 LC-MS、GC-MS 和 NMR 等技术对生物合成产物进行检测、定量分析和手性分析。
蛋白质相关实验：进行蛋白质表达、纯化，测定其晶体结构，并开展酶活性检测和 ITC 分析等。

关键技术路线

构建 PKS TR 文库，筛选并鉴定具有活性的 TR，确定其辅酶偏好性和底物范围。
利用 Retrobiosynthesis 软件设计生产目标产物的 PKS 结构，选择 rimocidin（Rim） PKS 进行工程改造，将其与 TR 融合，在微生物宿主中表达并检测产物。
通过优化培养基、筛选 TR、调控 CoA 底物池和过表达相关酶等策略，提高目标产物的产量和比例。
利用 AT 结构域交换和 PKS 后修饰反应，生产支链二醇、氨基醇和羟基酸等多种化合物。

研究结果

PKS TRs 以醛基终止聚酮

研究人员构建 PKS TR 文库，选取 9 个 TR 进行研究。通过对 TR1 和 TR9 的实验，发现它们是 NADPH 依赖的终止酶，可将聚酮底物还原为醛，且不能进一步将醛还原为醇。解析 CpkC TR（TR1）与 NADP?结合的晶体结构发现，其结构特征解释了对 NADP?的偏好，且与其他还原酶在结构上存在差异，尤其是在 HTH 基序等区域，表明不同还原酶在底物结合模式上有所不同。

工程改造 rimocidin PKS 和 TRs 用于 1,3 - 二醇生产

运用 ClusterCAD RetroTide 软件设计生产 2-E-1,3-HDO 的 PKS 结构，选择 Rim PKS 进行研究。由于 Rim PKS 加载模块 RimM0 在E. coli中表达时难以获得可溶性蛋白，研究人员转而研究其同源蛋白 PimS0，确认其起始模式。将 RimM0 基因整合到Streptomyces albus J1074 和Streptomyces coelicolor M1152 中，筛选出合适的启动子驱动其表达。构建Streptomyces albus RimM0M1 - TR1（QD27）菌株，成功检测到 1,3 - 丁二醇（1,3-BDO）、1,3 - 戊二醇（1,3-PDO）和 1,3 - 己二醇（1,3-HDO）的产生，证明 PKS - TR 工程用于二醇生物合成的可行性。进一步研究发现，宿主中未知的醇脱氢酶（ADHs）催化了醛到 1,3 - 二醇的转化。

探索可调 PKS-TR 平台的工程策略

筛选多种培养基后发现，Streptomyces albus QD27 在 R5 培养基中 72h 内产生的 1,3 - 二醇产量最高。测试 8 种 RimM0M1 - TR1/2/3/4/6/7/8/9 嵌合体，确定 RimM0M1 - TR2（QD28）是生产 1,3 - 二醇的最佳菌株。通过 ITC 分析、AlphaFold 3 预测等研究发现，RimM1 ACP 与 TR 的相互作用、TR 对 CoA 底物的招募以及嵌合蛋白的稳定性和丰度等因素影响二醇的生产效率。添加 l - 缬氨酸可提高 1,3-HDO 的产量和比例，过表达 crotonyl-CoA 羧化酶 / 还原酶（CCR）基因（如 rimJ CCR 和 fkbS CCR）并调整葡萄糖浓度，可显著提高 1,3 - 二醇的总产量。此外，过表达外源 ADH 基因（如 yahK）可进一步提高 1,3 - 二醇的产量，且产物为 100%（3R）- 二醇，证明了 PKS 的严格立体特异性。

中长链和支链二醇的生物合成

通过 AT 结构域交换策略，研究人员利用 PKS - TR 平台生产支链二醇。将 PKS 延伸模块中丙二酰 - CoA 特异性 AT 替换为甲基丙二酰 - CoA 特异性 AT（如 RimM7 AT 或 PimM7 AT），构建的菌株可生产 2 - 甲基 - 1,3 - 丁二醇（2-M-1,3-BDO）等多种甲基支链二醇，且产物的非对映体比例高。将 AT 替换为乙基丙二酰 - CoA 特异性 AT（如 RimM13 AT），构建的菌株最初未产生 2-E-1,3-HDO，仅生成 2 - 乙基 - 3 - 羟基己酸。通过向菌株中引入特定的 CAR 和 ADH，最终成功生产出 2-E-1,3-HDO 。

通过 PKS 后转氨作用生物合成氨基醇

将来自 coelimycin 和 B24891 BGCs 的 TA1 和 TA2 基因整合到Streptomyces albus RimM0M1 - TR1（QD27）和 RimM0M1 - TR2（QD28）中，构建的菌株成功产生 4 - 氨基丁 - 2 - 醇、1 - 氨基戊 - 3 - 醇和 1 - 氨基己 - 3 - 醇等氨基醇。通过调控 CoA 底物（如添加 l - 缬氨酸）和过表达相关基因（如 FkbS），可调整氨基醇的产物分布。蛋白质丰度分析表明，TR 和 TA 的表达水平影响氨基醇的产量，而细胞内 NAD (P) 水平在不同工程菌株中相似，排除了其对产物产量的影响。

研究结论与讨论

该研究开发了含末端硫还原酶（TR）的 PKS，实现中长链和支链醛的生物合成，进而生产多种二醇、氨基醇和羟基酸。相比传统途径，PKS 生物合成路线具有热力学优势，且能生产多种不同分子，产物分布易于微调。通过底物 CoA 池工程，可实现 RimPKS - TRs 产物分布的可调性。研究还发现 PKS TRs 是 NADPH 依赖的，且与 PKS KRs 在进化上相关，其底物识别机制与其他还原酶存在差异。

这项研究提供了全面的 PKS - TR 工程策略，为 PKS 逆向生物合成提供了有价值的工具包，为改造 PKS 设计方案生产非天然醇和胺奠定了基础。该策略有望拓展中长链和支链产物的生物合成途径，对化工、材料和医药等行业的可持续发展具有重要意义，未来可进一步探索该平台在更多复杂化合物生物合成中的应用潜力。