编辑推荐：
在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的发展代谢失调仍有待了解。在这里，作者发现抑制TBK1-mTORC1信号传导和糖酵解的肉碱合成酶BBOX1在ccRCC中经常丢失。
肾透明细胞癌研究新突破：BBOX1 的抑癌机制解析
美国德克萨斯大学西南医学中心病理学系的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “BBOX1 restrains TBK1-mTORC1 oncogenic signaling in clear cell renal cell carcinoma” 的论文。该研究首次揭示了 γ- 丁基甜菜碱羟化酶 1（BBOX1）在肾透明细胞癌（ccRCC）中的抑癌作用及相关机制，为 ccRCC 的治疗提供了新的潜在靶点和理论依据，对推动 ccRCC 的精准治疗具有重要意义。
研究背景
ccRCC 起源于肾近端小管上皮细胞，是一种代谢性疾病，约占肾癌的 85%。2022 年，美国约有 79,000 例肾癌新发病例和 13,390 例死亡病例，且肾癌发病率在过去几十年持续上升。ccRCC 对化疗耐药，虽然部分患者对 HIF2α 抑制剂有反应，但仍有相当比例的患者对此类药物耐药，因此寻找新的治疗靶点迫在眉睫。
ccRCC 具有独特的代谢特征，表现为有氧糖酵解增强和线粒体呼吸抑制，葡萄糖代谢在其发展中起重要作用。mTORC1 和 HIF 等信号通路在 ccRCC 中常被激活，它们驱动了糖酵解代谢重编程。BBOX1 作为肉碱合成的关键酶，参与脂质代谢，此前研究发现其在不同癌症中作用各异，然而其在肾癌中的作用尚不明确。
研究材料与方法
- 细胞系与细胞培养：使用多种细胞系，包括从 ATCC、Sigma Aldrich 等购买的细胞系，以及来自其他实验室馈赠的细胞系。细胞培养根据不同细胞类型选择相应培养基，并在含 10% FBS 和 1% 青霉素 / 链霉素的培养基中，于 37°C、5% CO?条件下培养。在生理生长条件实验中，使用人血浆样培养基（HPLM）培养细胞至少 72 小时。
- 实验动物：6 - 8 周龄的 NOD SCID Gamma（NSG）小鼠用于异种移植研究，实验过程遵循 NIH 指南，并经德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
- 实验技术：运用蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫沉淀（IP）、蛋白质免疫共沉淀（Co - IP）、体外激酶测定、细胞活力测定、集落形成实验、软琼脂生长实验、RNA 测序（RNA - seq）、实时定量逆转录聚合酶链反应（RT - qPCR）、IP - 质谱分析（IP - MS）、肉碱测量、Seahorse XF ECAR 测量、体内同位素示踪、免疫组织化学（IHC）等技术进行研究。
研究技术路线
研究人员首先通过整合癌症基因组图谱（TCGA）数据，对 BBOX1 在多种癌症中的作用进行系统分析，发现其在 ccRCC 中的表达与患者生存显著相关。随后，在细胞和动物模型中研究 BBOX1 对 ccRCC 肿瘤发生的影响，并通过 RNA - seq 等技术探究其潜在机制。进一步利用质谱、免疫沉淀等技术鉴定与 BBOX1 相互作用的蛋白，确定 TBK1 为关键介导因子，并深入研究 BBOX1 - DCLK2 - TBK1 轴的调控机制。
研究结果
- BBOX1 在 ccRCC 中显著下调：通过对 TCGA 数据的综合分析、单细胞 RNA 测序、CPTAC 数据集分析、免疫组化染色、Western blot 和 qRT - PCR 等方法，研究人员发现 BBOX1 基因表达在 ccRCC 中与患者生存显著相关，高表达预示良好临床结局。BBOX1 在 ccRCC 原发肿瘤中的 mRNA 和蛋白水平均显著低于正常肾组织，且其表达与肿瘤分期、分级、分子亚型和淋巴结转移状态相关。在细胞系中，多数 ccRCC 细胞的 BBOX1 表达降低，且在恶性转化过程中 BBOX1 可能发生选择性沉默。
- BBOX1 抑制 ccRCC 体内肿瘤发生：在多个 ccRCC 细胞系中异位表达 BBOX1，发现其可显著抑制异种移植瘤生长，且该抑制作用依赖于其酶活性。敲除 BBOX1 则促进肿瘤生长。在生理相关条件下，BBOX1 在体内抑制 ccRCC 肿瘤生长，但在传统细胞培养基中对 ccRCC 细胞的体外集落形成和增殖无影响。
- BBOX1 抑制 ccRCC 细胞在生理培养基中的活力：在 HPLM 中，表达野生型 BBOX1（而非催化失活突变体）的 ccRCC 细胞活力降低，锚定非依赖性集落形成减少；敲除 BBOX1 则增加 A498 细胞在 HPLM 软琼脂中的集落生长。补充葡萄糖和谷氨酰胺可恢复 BBOX1 过表达导致的细胞活力降低，表明葡萄糖和谷氨酰胺是介导 BBOX1 功能的关键营养素，且葡萄糖作用更重要。
- BBOX1 抑制 ccRCC 肿瘤发生独立于其肉碱代谢功能：给予荷瘤小鼠肉碱处理，未观察到对 786 - O 肿瘤生长的抑制作用。分析 ccRCC 患者代谢组学数据集发现，肿瘤组织中肉碱及其衍生物水平高于正常组织。BBOX1 恢复表达对 786 - O 异种移植瘤和体外细胞中的肉碱水平影响较小，表明 BBOX1 抑制 ccRCC 独立于其在肉碱代谢中的经典作用。
- BBOX1 减弱 ccRCC 中的 mTORC1 信号通路：RNA - seq 和基因集富集分析（GSEA）显示，BBOX1 表达的肿瘤中 mTORC1 信号通路等关键代谢途径下调。在多种 ccRCC 异种移植瘤中，BBOX1 恢复表达显著降低 mTORC1 活性，敲除 BBOX1 则增加 mTORC1 活性。在 ccRCC 患者肿瘤中，BBOX1 与 mTORC1 信号呈显著负相关。
- BBOX1 在生理条件下抑制糖酵解：RNA - seq 数据表明糖酵解是 BBOX1 表达肿瘤中下调的关键途径之一。qRT - PCR 验证了 BBOX1 在体内抑制糖酵解相关基因的表达。体内同位素示踪实验显示，BBOX1 恢复表达降低了肿瘤中糖酵解中间产物和 TCA 循环中间产物的葡萄糖衍生标记。Seahorse 实验表明，在 HPLM 中，BBOX1 过表达降低 ccRCC 细胞的糖酵解速率和能力，敲除 BBOX1 则增加糖酵解活性。
- TBK1 是 BBOX1 在 ccRCC 中发挥功能的关键介导因子：通过 IP - MS 鉴定出与 BBOX1 相互作用的蛋白，聚焦于 TBK1。免疫沉淀实验证实 BBOX1 与 TBK1 在 ccRCC 异种移植瘤中有强烈相互作用，且该相互作用依赖于 BBOX1 的酶活性。在 A498 细胞中，同时敲低 TBK1 和 BBOX1 可消除 BBOX1 敲除导致的 mTORC1 激活、糖酵解增强和细胞生长促进作用，表明 TBK1 在 BBOX1 依赖性肿瘤抑制中起关键作用。
- TBK1 在生理条件下对 mTORC1 激活和糖酵解至关重要：在 786 - O 或 A498 细胞中，敲低 TBK1 仅在 HPLM 中抑制 mTORC1 活性，过表达 TBK1 或其磷酸模拟突变体 S172D 则增加 mTORC1 活性。TBK1 抑制剂 CMPD1 处理降低了 HPLM 中 mTORC1 活性。Seahorse 实验表明，TBK1 敲低减少了 HPLM 中 ccRCC 细胞的糖酵解，过表达 S172D 则增加糖酵解。体内实验显示，TBK1 敲低抑制 ccRCC 肿瘤生长，降低 mTORC1 活性并抑制糖酵解相关基因表达。
- BBOX1 通过减弱 DCLK2 - TBK1 相互作用抑制 TBK1 激活：在生理条件下，BBOX1 恢复表达降低 TBK1 活性，敲除 BBOX1 则增加 TBK1 磷酸化。BBOX1 与 TBK1 间接相互作用，通过与 DCLK2 结合，阻止 DCLK2 - TBK1 相互作用，从而抑制 TBK1 激活。在 293T 细胞中，BBOX1 表达增加减少了内源性 TBK1 与 DCLK2 - 203 的结合，体外激酶实验表明重组 BBOX1 可减弱 DCLK2 对 TBK1 的磷酸化作用。
研究结论与讨论
该研究确定 BBOX1 为 ccRCC 中一种新的肿瘤抑制因子，其在生理条件下通过减弱 TBK1 介导的 mTORC1 和糖酵解激活来抑制肿瘤发生。机制上，BBOX1 通过拮抗其上游激活剂 DCLK2 来抑制 TBK1 激活。BBOX1 在 ccRCC 中的抑癌作用独立于其在肉碱代谢中的经典作用，这与在肝细胞癌中的作用不同，表明 BBOX1 在不同癌症类型中发挥着多面性的作用。
研究还发现 BBOX1 在体内具有抑癌功能，但在传统培养基中对细胞生长无影响，这种差异可能与培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度有关。此外，BBOX1 表达在 ccRCC 中普遍下调，且其调控机制可能涉及表观遗传或转录调控。TBK1 作为 BBOX1 下游的关键功能介导因子，在维持 ccRCC 中 mTORC1 和糖酵解活性中起重要作用。
尽管该研究取得重要进展，但仍存在一些局限性。例如，尚未明确 BBOX1 缺失在 ccRCC 起始阶段的后果，BBOX1 在生理条件下调节 TBK1 活性和 ccRCC 肿瘤发生的精确机制仍不清楚，BBOX1 是否依赖葡萄糖 / 谷氨酰胺代谢的某些营养中间体发挥功能也有待进一步研究。未来研究可通过构建基因工程小鼠模型等方法深入探究这些问题。
总体而言，该研究揭示了 BBOX1 在 ccRCC 中的重要作用，为 ccRCC 的治疗提供了新的潜在靶点和生物标志物，有望推动 ccRCC 治疗策略的发展。
