6-羟多巴胺治疗帕金森病小鼠儿茶酚胺能去神经、神经变性和炎症的映射

　　

6-OHDA 处理的帕金森病小鼠中儿茶酚胺能神经支配缺失、神经退行性变和炎症的研究解读

斯坦福大学医学院神经外科的 Matteo Santoro 等人在npj Parkinson’s Disease期刊上发表了题为 “Mapping of catecholaminergic denervation, neurodegeneration, and inflammation in 6-OHDA-treated Parkinson’s disease mice” 的论文。该研究通过对 6-OHDA 处理的帕金森病小鼠进行多方面的研究，为深入理解帕金森病的病理机制提供了重要依据，也为开发新的治疗方法奠定了基础。

帕金森病（PD）是一种复杂的神经退行性疾病，具有运动和非运动症状，其病理特征难以在啮齿动物和非人灵长类动物模型中完全复制。这一疾病的多面性使得建立能准确反映其复杂病理生理学的实验系统变得困难，当前治疗方法主要集中于症状管理，尚未有能治愈或延缓神经退行性变的确定性疗法。在众多帕金森病模型中，6 - 羟基多巴胺（6-OHDA）输注小鼠模型自 2012 年起受到关注，该模型主要聚焦于黑质纹状体区域。本研究旨在全面表征单侧 6-OHDA 注入小鼠背侧纹状体后的组织病理学和生化变化，以更深入地了解帕金森病的病理机制。

研究选用 8 周龄雄性和雌性 C57BL/6 小鼠，将其随机分组，在环境可控的房间中饲养。实验操作遵循相关动物护理和使用指南，经斯坦福大学行政小组批准，并符合 AAALAC 标准。6-OHDA 处理时，小鼠先适应环境一周，然后根据体重和性别随机分组，手术前进行 4 天的适应处理。麻醉后，在数字立体定位框架下，通过对流增强递送（CED）将 6-OHDA 或载体（USP 盐水含 0.03% 抗坏血酸）单侧注入背侧纹状体，设置 5μg、10μg、20μg 三个剂量组，注射速率为 0.5μL/min，注射后留针 5 分钟再缓慢拔出，缝合切口。术后给予相应护理，包括皮下注射生理盐水、布托啡诺等。

为评估 6-OHDA 诱导的损伤程度，在不同时间点（第 1、3、7、14 天）处死小鼠。通过蛋白质免疫印迹（WB）分析纹状体中酪氨酸羟化酶（TH）蛋白水平，对大脑指定区域进行快速解剖和速冻处理；对黑质致密部（SNpc）的 TH + 细胞进行组织学评估时，先将后脑在 4% 多聚甲醛中固定 48 小时，再在含 30% 蔗糖的 0.1M 磷酸盐缓冲液中冷冻保存。用免疫组织化学方法对 SNpc 中的免疫反应性 TH + 细胞进行染色和定量分析，采用光学分割法对 TH + 神经元进行立体计数。此外，还通过 WB 检测特定蛋白的表达和磷酸化状态，用 48 重小鼠细胞因子 / 趋化因子检测法检测 SNpc 中的炎症标记物，利用免疫染色和 iDISCO + 技术处理大脑组织，通过光片显微镜（LSFM）进行成像，并使用 UNRAVEL 等工具进行数据分析。

6-OHDA 神经毒性在 TH + 细胞及其投射中的全脑分布

对单侧注入 20μg 6-OHDA 或载体的雄性小鼠大脑进行处理和成像，利用 UNRAVEL 自动化全脑映射 TH 免疫标记并量化相关变化。通过体素分析发现，在多巴胺能神经元区域，6-OHDA 处理后主要是 SNpc 中的 TH + 细胞减少，而在去甲肾上腺素能区域未观察到 TH + 细胞损失。6-OHDA 导致双侧 TH + 纤维广泛丢失，在注入侧和对侧半球均有明显表现，同时在部分区域出现 TH + 纤维密度的代偿性增加。这一结论是通过对大量体素的统计分析，结合对不同脑区 TH + 细胞和纤维密度的精确测量得出的。

6-OHDA 黑质纹状体损伤的特征 —— 性别、剂量和时间进程差异

通过 WB、立体计数和平均荧光强度测量等方法，研究不同剂量 6-OHDA 对雄性和雌性小鼠的影响。结果显示，雄性小鼠纹状体中 TH 蛋白水平在 5μg 6-OHDA 注入后 14 天逐渐下降，10μg 和 20μg 剂量则在注入后 24 小时就显著降低；雌性小鼠对 6-OHDA 毒性的敏感性较低，在 5μg 和 10μg 剂量组中，纹状体 TH 蛋白水平在第 14 天未受明显影响。在 SNpc 中，雄性小鼠的 TH + 细胞数量和 TH 表达在各剂量组均在第 14 天显著下降，而雌性小鼠对 6-OHDA 毒性具有抗性，TH + 细胞数量和相关指标变化不明显。这些结论是基于对不同剂量组和不同时间点的多指标检测数据得出的。

6-OHDA 在神经元丢失前触发神经炎症

在 6-OHDA 注入区域，通过 WB 检测发现注入 3 天后炎症标记物明显上调。对注入 20μg 6-OHDA 的雄性小鼠 SNpc 进行 48 重细胞因子 / 趋化因子检测，发现多个炎症标记物表达改变，部分在不同时间点持续上调，部分在特定时间点增加，还有的如 VEGF 在第 7 天下降。同时，研究还发现 6-OHDA 影响了相关激酶的磷酸化状态，DAPK1 磷酸化水平降低，提示局部兴奋性毒性和促凋亡信号，而 GSK-3β 和 AKT 的磷酸化变化表明它们未促进促凋亡信号。这些结果是通过对炎症标记物的检测和激酶磷酸化状态的分析得出的。

研究通过多种实验方法全面表征了 6-OHDA 小鼠模型的病理变化。发现 6-OHDA 诱导的神经退行性变主要局限于 SNpc，并伴有广泛的双侧去神经支配和皮质下区域 TH 的代偿性上调。雄性小鼠病理变化更严重，雌性小鼠对 6-OHDA 毒性具有一定抗性，可能与雌激素的神经保护作用有关。6-OHDA 注入后，神经炎症反应在神经元丢失前就已发生，呈现出特定的细胞因子 / 趋化因子特征，且与 PD 患者的细胞因子谱存在差异。此外，研究还确定了相关激酶在 6-OHDA 诱导的病理过程中的作用。

该研究为 6-OHDA 小鼠模型提供了详细的特征描述，有助于深入理解帕金森病的病理机制。其创新性的研究方法可应用于其他神经退行性疾病模型的研究。研究结果为开发针对帕金森病的神经保护和免疫调节治疗方法提供了重要的理论依据，对未来帕金森病的治疗研究具有重要的指导意义。