基于细胞间 “网络” 靶向肌浆网治疗心肌缺血再灌注损伤：开启心脏保护新征程

本文构建了基于中性粒细胞（NEs）细胞间 “网络”（NETwork）的肌浆网（SR）靶向递送系统（L-P-NPs@NEs）治疗心肌缺血再灌注损伤（MIRI）。该系统经组织、细胞、亚细胞三级靶向，恢复 SR Ca2+-ATPase（SERCA）活性，改善心脏功能，为 MIRI 等肌肉疾病治疗提供新思路。

　　

研究背景

心血管疾病（CVD）是全球主要死因之一，急性心肌梗死（AMI）是 CVD 中导致死亡和发病的重要原因。目前针对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的治疗策略存在不足，MIRI 会引发氧化损伤、Ca²⁺超载和炎症免疫反应等，破坏心肌细胞亚细胞区室的稳态。

肌浆网（SR）作为内质网的特殊形式，在心肌和骨骼肌细胞中调节钙稳态，维持兴奋 - 收缩偶联这一肌肉生理的基本过程。MIRI 会导致活性氧（ROS）快速生成，损害 SR 中的 SERCA 功能，阻碍细胞质 Ca²⁺返回 SR，引发 Ca²⁺超载诱导的细胞损伤和心律失常。已有研究表明，重新激活 SERCA 可纠正 Ca²⁺超载，但以 SERCA 为药物靶点的治疗策略缺乏，主要原因是药物难以有效递送至病变心肌细胞的 SR。

利用炎症这一 MIRI 的关键病理生理特征，基于中性粒细胞（NEs）的药物递送系统可通过细胞间 “网络”（NETwork）克服组织和细胞水平的靶向障碍，但此前的系统在亚细胞水平靶向存在局限。本研究旨在拓展 NETwork 介导的药物靶向模式，构建能实现亚细胞靶向的药物递送系统，用于治疗 MIRI 及其他肌肉疾病。

实验设计

本研究设计的药物递送系统 L-P-NPs@NEs 包含两个关键模块：一是趋化性 NEs 作为 “活体仓库”，将纳米颗粒有效载荷运输到 MIRI 模型中炎症损伤心脏部位的受损心肌细胞；二是对甲苯磺酰胺修饰的纳米颗粒促进治疗药物精确递送至 SR。研究选用木犀草素（Lut）作为治疗药物，它能逆转 SERCA 功能障碍并通过调节 SUMOylation 提高其稳定性。

实验方法

1. 材料准备：购买多种实验所需的材料和试剂，包括 PLGA、大豆磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀-OMe、DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂、木犀草素（Lut）、对甲苯磺酰等。使用大鼠 H9C2 细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、小鼠 C2C12 细胞、原代心肌细胞、原代骨骼肌成肌细胞以及 BALB/c 小鼠和 C57BL/6 小鼠进行实验，所有动物实验均经四川大学医学伦理委员会批准。
2. 纳米颗粒制备与表征：通过纳米沉淀法制备 Lut 负载的纳米颗粒（L-P-NPs 和 L-M-NPs），对其进行表征，包括测定流体动力学直径、zeta 电位、观察形态、评估 Lut 负载能力和包封率，以及进行体外稳定性和药物释放实验。
3. 细胞和动物模型构建：构建 MIRI 小鼠模型，通过结扎冠状动脉左前降支（LAD）诱导心肌缺血，再灌注后进行实验。构建骨骼肌炎症模型，通过向 BALB/c 小鼠右股二头肌注射脂多糖（LPS）诱导炎症。
4. 靶向能力和治疗效果评估：在体外和体内评估 L-P-NPs 的 SR 靶向能力，观察 L-P-NPs@NEs 的制备和特性，检测其趋化功能、药物释放、细胞间转运以及在体内对 IR 心脏和 SR 的靶向能力。在体外和体内评估 L-P-NPs@NEs 对氧化应激损伤的缓解作用和治疗效果，包括检测 SERCA 活性、Ca²⁺水平、ROS 水平、线粒体功能、细胞活力等指标，以及进行组织学分析、心电图检测、超声心动图评估等。评估 L-P-NPs@NEs 在骨骼肌炎症模型中的靶向和治疗效果，以及进行生物安全性评估。

实验结果

1. L-P-NPs 的制备和表征：制备的 L-P-NPs 平均粒径约 155nm，呈球形，多分散指数窄，表面带负电，药物负载量为 5.18 ± 0.32%，包封率超 70%，在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）中稳定且具有持续释药特性。
2. L-P-NPs 的体外靶向性：在多种肌肉细胞（H9C2 细胞、C2C12 细胞、原代心肌细胞、原代骨骼肌成肌细胞）中，P-NPs 能有效靶向 SR，其绿色荧光与 SR 红色荧光重叠度高，Pearson 相关系数（Rr）显著高于非修饰纳米颗粒组。但在体内，DID-P-NPs 和 DID-M-NPs 无法靶向受伤心脏，易在肝脏积累。
3. L-P-NPs@NEs 的制备和特性：从骨髓中分离 NEs，纯度约 93%，DID-P-NPs 可被 NEs 高效摄取形成 DID-P-NPs@NEs，L-P-NPs@NEs 的负载量为 3.58μg Lut/10⁶细胞，制备过程未显著改变 NEs 的形态和蛋白质完整性。
4. L-P-NPs@NEs 的趋化功能：L-P-NPs@NEs 能有效维持 NEs 的趋化功能，在炎症刺激下，其超氧阴离子水平和 CD11b 表达与 NEs 无显著差异，在多种体外模型中，L-P-NPs@NEs 能响应受损心肌细胞分泌的炎症信号，促进细胞内有效载荷的跨内皮迁移。
5. L-P-NPs@NEs 的药物释放和细胞间转运：在正常生理条件和趋化过程中，L-P-NPs@NEs 中的 Lut 释放极少，在炎症刺激（PMA 处理）下，Lut 快速释放，且释放的 P-NPs 保持完整，能从 NEs 释放并被 H9C2 细胞内化，最终定位于 SR。
6. L-P-NPs@NEs 的体内靶向性：在 MIRI 小鼠模型中，DID-P-NPs@NEs 能有效靶向缺血再灌注心脏，其心脏荧光强度显著高于其他组。DID-P-NPs@NEs 主要被受损心肌细胞内化，且 Cou6-P-NPs@NEs 在体内能特异性有效靶向 SR，其荧光与 SR 的共定位程度更高。
7. L-P-NPs@NEs 对氧化应激损伤的缓解作用：在体外，L-P-NPs 和 L-P-NPs@NEs 能有效激活 SERCA，降低细胞内 Ca²⁺和 ROS 水平，减少线粒体通透性转换孔（MPTPs）开放，减轻线粒体钙超载，增加细胞内 ATP 生成，提高细胞活力，保护心肌细胞。
8. L-P-NPs@NEs 在 MIRI 模型中的治疗效果：在 MIRI 小鼠模型中，L-P-NPs@NEs 在短期治疗中，能显著提高 SERCA 活性，改善心肌细胞超微结构，抑制细胞凋亡，降低血清心脏损伤相关细胞因子水平，减少心律失常；在长期治疗中，能显著改善心脏功能，减少心室重构，降低瘢痕形成和左心室壁厚度，抑制心肌细胞肥大，促进心脏电活动正常化。
9. L-P-NPs@NEs 在骨骼肌炎症模型中的治疗效果：在骨骼肌炎症模型中，DID-P-NPs@NEs 能有效靶向炎症损伤的骨骼肌和 SR，L-P-NPs@NEs 能恢复 SERCA 活性，抑制肌肉细胞死亡，减轻炎症，减少肌肉水肿，改善肌肉收缩功能。
10. L-P-NPs@NEs 的生物安全性：4 周的生物安全性评估显示，L-P-NPs@NEs 无明显全身毒性，未观察到炎症加重，对主要器官的血清生化、血液学和组织病理学检查结果与对照组无显著差异。

研究结论

本研究构建的 L-P-NPs@NEs 系统通过细胞间远程相互作用介导的炎症归巢实现组织水平靶向，NETwork 促进 L-P-NPs 运输至受损心肌细胞实现细胞水平靶向，对甲苯磺酰胺修饰的纳米颗粒介导 SR 识别和定位实现亚细胞水平靶向，成功将 Lut 递送至 MIRI 受损心肌细胞的 SR，激活 SERCA，发挥一系列保护作用，有效治疗 MIRI。该系统在骨骼肌炎症模型中也展现出良好的靶向和治疗效果，且具有生物安全性，为治疗 MIRI 及其他肌肉疾病提供了新的策略和潜在的通用 SR 靶向平台。然而，该研究仍存在局限性，如 NEs 的获取和使用存在挑战，需要进一步优化纳米颗粒负载策略以维持 NEs 活力，未来需解决这些问题以推动其广泛应用。