硫氧还蛋白相关跨膜蛋白1作为预后指标，促进低级别胶质瘤的增殖和TMZ耐药

　　

硫氧还蛋白相关跨膜蛋白 1 在低级别胶质瘤中的研究进展

在当今肿瘤研究领域，探寻有效的生物标志物和治疗靶点一直是攻克癌症难题的关键方向。近期，来自新乡医学院第一附属医院临床药学系等多个单位的研究人员取得了一项重要成果，他们的研究论文Thioredoxin related transmembrane protein 1 acts as a prognostic indictor and promotes proliferation and TMZ resistance of lower - grade glioma发表于Scientific Reports期刊。这一研究聚焦于低级别胶质瘤（LGG），深入剖析了硫氧还蛋白相关跨膜蛋白 1（TMX1）在其中的作用，为 LGG 的治疗提供了新的思路和潜在靶点，对推动神经肿瘤学领域的发展具有重要意义。

论文的第一作者单位为新乡医学院第一附属医院临床药学系，该单位在临床药学研究方面积累了丰富的经验，此次研究成果展现了其在肿瘤相关研究领域的深厚实力。研究团队综合运用生物信息学分析、细胞实验和动物实验等多种方法，全面且深入地探究了 TMX1 与 LGG 之间的关联，为后续的临床治疗和研究奠定了坚实基础。

研究背景

胶质瘤起源于神经上皮，约占脑肿瘤的 80%，是中枢神经系统中最常见的癌症类型。世界卫生组织（WHO）依据恶性程度将胶质瘤分为 I - IV 级，其中 II、III 和 IV 级胶质瘤由于具有浸润性特征、手术切除困难以及放化疗耐药性等问题，患者预后相对较差。尽管免疫疗法和靶向疗法等多种肿瘤治疗策略展现出一定前景，但胶质瘤患者的 5 年生存率仍不尽人意。部分低级别胶质瘤在接受标准治疗后会复发并进展为高级别胶质瘤，且常出现获得性耐药现象。因此，寻找有效的生物标志物和靶点来改善胶质瘤患者的治疗效果、克服化疗耐药性迫在眉睫。

硫氧还蛋白相关跨膜蛋白 1（TMX1）编码一种硫醇 - 二硫键氧化还原酶，能够调节蛋白质中半胱氨酸残基之间二硫键的裂解、形成或异构化。在细胞的正常生理过程中，TMX1 对蛋白质的精确折叠和组装起着至关重要的作用。已有研究表明，硫醇 - 二硫键氧化还原酶在癌症化疗中扮演着重要角色，部分氧化还原酶可赋予癌细胞对多种化疗药物的耐药性。然而，TMX1 在癌症发生发展以及药物耐药性方面的作用尚未完全明确，这也为本次研究提供了切入点。

研究材料与方法

数据获取与处理

研究人员从基因型 - 组织表达（GTEx）数据集和癌症基因组图谱（TCGA）数据集分别获取人类正常组织和肿瘤样本的转录组数据。所有可检索数据均从 UCSC Xena 数据库和 CGGA 数据集下载，并在分析前将数据格式转换为每千碱基百万转录本（TPM） 。

多种分析方法

利用 R 包 “timeROC” 进行受试者工作特征（ROC）曲线分析，以此评估 TMX1 表达及其他预测因子（包括 WHO 分级、性别、年龄、IDH 状态和 1p/19q 状态）对 1/3/5 年总生存率的预后预测能力，并计算曲线下面积（AUC）值。在 R 编程平台上使用 “rms” 包进行列线图模型的构建与验证，以 TCGA - LGG 队列作为训练队列，通过 Cox 回归方法建立基于 TMX1 的列线图，并在 CGGA - LGG 队列中验证其预后预测能力，同时绘制校准图和计算 C 指数。运用 R 包 “limma” 对每种癌症类型中高 TMX1（前 30% 样本）和低 TMX1（后 30% 样本）亚组进行差异表达分析，获取差异表达基因（DEGs） ，再使用 “clusterProfiler” 包进行基因集富集分析（GSEA） ，并利用 “ggplot2” 包绘制气泡图展示结果。借助 R 包 “clusterProfiler” 对 LGG 样本中的 DEGs 进行基因本体（GO）分析，涵盖生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）三个模块，并绘制柱状图展示 Q 值。

细胞实验

选用 SW1088 和 SW1783 细胞系，从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取后，在含有 10% 胎牛血清和 100U/ml 青霉素 - 链霉素溶液的最低限度基本培养基（MEM）中培养，置于 37°C、100% 湿度的细胞培养箱中。从新乡医学院第一附属医院神经外科收集 19 例胶质瘤样本和 7 例相邻脑样本，样本的采集和保存遵循医院规定及赫尔辛基准则，患者均签署知情同意书，研究也获得医院伦理委员会批准。购买 Proteintech 公司的 TMX1 多克隆抗体等多种抗体和试剂，用于后续实验检测。设计并构建表达 shRNA 靶标的质粒，由 Genechem 公司完成，之后严格按照 addgene 网站的程序进行慢病毒包装。采用 RIPA 裂解缓冲液提取胶质瘤细胞蛋白质，通过 BCA 法测定蛋白质浓度，进行 SDS - PAGE 电泳后，将蛋白质转移至 PVDF 膜，经封闭、孵育一抗和二抗，使用增强化学发光试剂盒显色，并用 Image J 软件定量分析蛋白质表达。使用 RNAsimple Total RNA Kit 提取胶质瘤细胞总 RNA，合成互补 DNA（cDNA）后，在 qTower3 PCR 系统上进行定量实时 PCR（RT - qPCR） ，测定 RNA 表达水平。采用 CCK - 8 法评估细胞活力，将对数期细胞接种于 96 孔板，在指定时间点加入 CCK - 8 溶液，测定 450nm 波长处的光密度（OD）值。进行集落形成实验，将细胞接种于六孔板，每 3 天更换培养基，第 15 天固定、染色细胞，拍照并计数细胞集落。

动物实验

动物实验遵循新乡医学院第一附属医院医学伦理委员会的指导原则以及英国 1986 年《动物法案》 ，研究编号为 EC - 024 - 444。将 TMX1 敲低或对照的 SW1088 或 SW1783 细胞（10×10?个细胞 / 100μl PBS）皮下注射到 6 周龄 BALB/c 雌性裸鼠体内，建立体内星形细胞瘤模型。每周测量并记录肿瘤大小，按照公式计算肿瘤体积。在肿瘤细胞接种后的第 5、10、15、20 和 25 天，通过腹腔注射给予裸鼠 PBS 或替莫唑胺（TMZ，30mg/kg/ 剂量） 。

统计分析

运用 Wilcoxon 和检验确定癌症与癌旁正常组织中 TMX1 表达水平差异的统计学意义。采用单变量 Cox 回归和 Kaplan - Meier 分析评估 TMX1 表达对每种癌症预后的影响，计算 p 值、风险比（HR）以及 95% 置信区间（CI）的 log - rank p 值，并绘制生存分析数据可视化热图。使用 Pearson 相关方法评估 TMX1 与免疫细胞浸润、细胞增殖、干性标记物和 TMZ 敏感性评分之间相关性的显著性，通过 R 值和 p 值进行评估。

研究结果

TMX1 在癌症中异常上调

通过对比 GTEx 数据集中正常组织和 TCGA 数据集中肿瘤样本的 TMX1 表达水平，研究人员发现，在众多人类癌症样本中，TMX1 的 mRNA 表达显著升高。在 33 种癌症类型里，有 27 种呈现高表达，仅有 4 种癌症（KIRP、UCS、ACC 和 KICH）中 TMX1 表达下调，这一结果初步表明 TMX1 在癌症生物学中可能具有重要意义。

高 TMX1 表达与 LGG 患者预后不良相关

研究人员针对每种癌症类型，通过 log - rank 检验和单变量 Cox 回归分析，探究 TMX1 对癌症预后的潜在影响。热图和森林图结果显示，在 LGG 患者中，较高的 TMX1 表达与较差的临床预后相关（HR = 1.75，p 值 = 3.8e - 4） 。 Kaplan - Meier 生存曲线分析进一步证实，在 TCGA - LGG 队列中，LGG 患者较高的 TMX1 表达与更差的总生存期和无病生存期相关。在 CGGA - LGG 队列中，也得到了一致的结果，这充分表明 TMX1 表达水平与 LGG 患者的预后密切相关。

TMX1 在 LGG 患者中的临床关联

为了深入了解 TMX1 表达与 LGG 临床病理特征之间的关系，研究人员对不同 LGG 亚型（包括 WHO II 级与 III 级、1p/19q 缺失与非共缺失、IDH 突变型与野生型）的 TMX1 表达进行了比较。在 TCGA 队列中，WHO III 级 LGGs 的 TMX1 表达明显高于 II 级；1p/19q 非共缺失和 IDH 野生型 LGGs 的 TMX1 表达分别高于 1p/19q 共缺失和 IDH 突变型 LGGs。CGGA LGG 队列的结果与之相符，这进一步证实了 TMX1 与 LGG 恶性程度之间存在紧密联系。此外，通过单变量 Cox 回归分析发现，TMX1 是 LGG 患者稳定的预后因素。ROC 曲线分析表明，TMX1 在预测 LGG 患者的临床结局方面具有稳定且良好的预测能力，这为将 TMX1 作为 LGG 预后生物标志物提供了有力支持。

基于 TMX1 的列线图有效预测 LGG 患者预后

研究人员利用训练 TCGA 队列构建了基于 TMX1 表达的列线图，该列线图纳入了 WHO 分级、IDH 状态、1p/19q 共缺失状态和 TMX1 表达等重要预后因素。校准分析显示，该列线图模型在预测 LGG 患者 1/3/5 年总生存率方面具有较高的稳定性和准确性，无论是在 TCGA 队列还是 CGGA 队列中均得到验证。这表明基于 TMX1 的列线图能够为临床医生评估 LGG 患者的预后提供有效的工具。

TMX1 的基因集富集分析（GSEA）

在对每种癌症类型进行 GSEA 分析时，研究人员先对比高、低 TMX1 表达样本，筛选出差异表达基因，随后基于 50 个标志性基因集开展分析。结果以气泡图呈现，发现 TMX1 与 TNFα 信号通路（通过 NF - κB）、IFNγ 应答、IFNα 应答和炎症反应等标志性通路存在显著关联，在 LGG 中尤为明显。这意味着 TMX1 可能在调节癌症免疫反应方面发挥关键作用，为理解 LGG 的发病机制提供了新的视角。

TMX1 在 LGG 中的基因本体（GO）分析

利用 LGG 样本中与 TMX1 相关的差异表达基因进行 GO 分析，结果显示，在上调的差异表达基因分析中，TMX1 与细胞激活、白细胞激活、细胞因子产生以及通过 MHC II 类分子进行的抗原加工和呈递等过程呈正相关，这表明 TMX1 可能参与 LGG 微环境中的癌症免疫调节。而在下调的差异表达基因分析中，发现了与突触传递、膜电位和神经递质运输等相关的术语，这些与 TMX1 表达呈负相关，进一步揭示了 TMX1 在 LGG 中的复杂作用机制。

TMX1 与 LGG 中的免疫细胞浸润、增殖、干性和 TMZ 敏感性相关

借助 TIMER 平台对 TCGA - LGG 队列进行分析，研究人员发现 TMX1 与肿瘤纯度、B 细胞、CD8 + T 细胞、CD4 + T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平均呈正相关。同时，Pearson 分析表明，TMX1 与 LGG 中的 PCNA、MKI67、PROM1 和 SOX2 表达也呈正相关，这暗示 TMX1 可能参与调节 LGG 细胞的增殖和干性。此外，通过计算 TCGA 和 CGGA 队列中 LGG 样本的 TMZ 敏感性评分，并进行 Pearson 相关分析，发现 TMX1 表达与 LGG 患者的 TMZ 耐药性显著相关，为后续研究提供了重要线索。

TMX1 的敲低抑制 LGG 细胞增殖并促进体内外 TMZ 敏感性

研究人员通过免疫组化检测 3 对 LGG 样本及其相邻脑组织，发现 TMX1 在胶质瘤样本中的染色明显强于正常样本，且其主要定位于内质网。为进一步探究 TMX1 对 LGG 细胞增殖的影响，构建了 TMX1 敲低的 SW1088 和 SW1783 细胞系，经 RT - qPCR 和 Western blot 验证敲低效果良好。CCK8 和集落形成实验结果显示，TMX1 敲低显著抑制了细胞增殖和集落形成能力。体外实验表明，TMX1 表达降低使 SW1088 和 SW1783 细胞对 TMZ 的 IC50 值下降，意味着细胞对 TMZ 更敏感。体内实验中，将敲低 TMX1 的细胞植入裸鼠皮下并给予 PBS 或 TMZ 处理，结果显示敲低 TMX1 显著抑制了皮下肿瘤生长，且 TMZ 与 TMX1 敲低联合治疗效果最佳，同时免疫组化检测肿瘤增殖生物标志物 Ki67 也证实了敲低 TMX1 可抑制肿瘤增殖，增强肿瘤对 TMZ 的敏感性。

研究结论与讨论

综合生物信息学分析、体外和体内实验结果，该研究明确了 TMX1 可作为 LGG 患者理想且有前景的靶分子。抑制 TMX1 能够有效抑制星形细胞瘤细胞的增殖，并增强细胞对 TMZ 的敏感性，这为改善 LGG 患者的预后提供了新的潜在治疗策略。

TMX1 作为硫氧还蛋白超家族的成员，虽已知其在维持细胞氧化还原平衡和蛋白质折叠方面有重要作用，但在癌症中的具体机制尚未完全明晰。在本研究中，TMX1 在 LGG 患者中呈现上调，与 LGG 的预后紧密相关，且在 IDH 野生型、1p/19q 非共缺失和 WHO III 级 LGG 患者中高表达，与多种临床病理生物标志物存在显著关联。单变量 Cox 回归和 ROC 曲线分析表明，TMX1 是 LGG 患者有效的预后生物标志物，基于 TMX1 构建的列线图可增强对 LGG 预后的预测能力。GSEA 和 GO 分析揭示了 TMX1 在 LGG 免疫反应中的潜在作用，以及与免疫细胞浸润的显著相关性。此外，TMX1 还与 LGG 细胞的增殖、干性调节以及 TMZ 敏感性密切相关。

然而，该研究也存在一定的局限性。目前尚未在异种移植模型中测试通过基因治疗方法（如小分子抑制剂、siRNA/shRNA 或 Cas9 递送）靶向 TMX1 是否有效，且尚无特异性 TMX1 抑制剂，这为后续研究带来了挑战。同时，研究结论主要基于细胞系实验，若能在源自患者的原发性星形细胞瘤细胞中进行验证，结论将更具说服力。

尽管如此，该研究首次系统地阐述了 TMX1 在 LGG 中的作用，为 LGG 的治疗提供了新的靶点和理论依据。未来的研究可以围绕开发特异性 TMX1 抑制剂以及在更多临床样本中验证其治疗效果展开，有望为 LGG 患者带来更有效的治疗方案，改善患者的生存状况，推动神经肿瘤学领域的进一步发展。