细菌编码死后的蛋白质分解代谢，使无私的营养循环

死后发生的过程没有像生命机制那样受到同等程度的关注。在这项研究中，作者表明，细菌可能已经进化出一种利他的特性，在死后自动降解，从而允许种群营养循环。

　　

杜兰大学（Durham University）的 Savannah E. R. Gibson 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Bacteria encode post-mortem protein catabolism that enables altruistic nutrient recycling” 的论文。该研究在微生物营养循环领域具有重要意义，为深入理解细菌死后营养物质的再利用机制提供了新视角，有助于揭示微生物生态系统中物质循环的奥秘，对生物地球化学循环研究、新型抗菌策略开发等方面也具有潜在的指导价值。

研究背景

在自然界中，大多数细菌生长缓慢，营养限制是主要原因之一。细菌通常需要将环境中的大分子物质分解并吸收其营养成分，以维持自身生长。例如，在实验室微生物培养中，常用酶降解的酪蛋白（牛奶中的主要蛋白质成分）水解产物作为营养源，为细菌生长提供固定氮和氨基酸，因为完整的蛋白质通常太大，无法被细菌直接摄取 。由此推测，环境中死细菌裂解后释放的蛋白质也必须先被分解为小肽，才能支持其他活细胞的生长。然而，细菌死亡后大分子物质循环利用的潜在机制在很大程度上仍是未知的，这激发了研究人员对该课题的深入探索。

研究方法

1. 细菌裂解物制备：研究人员使用大肠杆菌（Escherichia coli）作为主要研究对象，将其在含有 1%（v/v）甘油的 M9 基本培养基中培养至光密度（）为 0.4，然后离心收集细胞，重悬于无菌去离子水中，通过超声处理使其裂解，裂解物经 0.22μm 滤膜过滤除菌，液氮速冻后保存于 - 80°C。同时，对处理后的裂解物进行无菌检测，确保其不会对后续实验产生干扰。
2. 细菌生长实验：将过夜培养的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）稀释至 = 0.2，取 50μL 稀释后的细菌与 50μL 细菌裂解物（或无菌水作为阴性对照）混合，使起始为 0.1，在 37°C（大肠杆菌）或 30°C（枯草芽孢杆菌）下振荡培养 1200 分钟，使用 SPECTROstar NanoTM 吸光板读数仪实时监测细菌生长情况。此外，通过在 LB 肉汤琼脂平板上进行菌落形成单位（CFU）计数，来进一步确认细菌的生长状况。
3. FITC - 酪蛋白检测：该检测用于评估 Lon 蛋白酶的活性。将 20μL 样品与 40μL 含有 100mM Tris pH7.8 和 10mM CaCl 的检测缓冲液以及 40μL 0.5%（w/v）的 FITC - 酪蛋白混合，在 37°C 下孵育 2 小时，期间不断搅拌。孵育结束后，加入 240μL 5%（w/v）的三氯乙酸（TCA）终止反应并沉淀蛋白质，混合均匀后在室温黑暗处静置 4 小时，离心收集上清液进行荧光检测，通过检测 525nm 处的荧光强度来间接反映 Lon 蛋白酶对酪蛋白的降解能力。
4. 蛋白质表达与纯化：利用携带相应质粒的大肠杆菌 BL21 菌株表达野生型和突变型的 Lon 蛋白酶。如表达野生型大肠杆菌 Lon 蛋白酶时，将携带 pBAD33 - lon 质粒的 BL21 菌株在含有氯霉素（34μg mL?1）的 2xYT 培养基中 37°C 培养，当达到 1.0 时，添加 0.2%（w/v）的 L - 阿拉伯糖诱导蛋白质表达 3 小时，之后收集细胞并冷冻保存。通过一系列复杂的蛋白质纯化步骤，包括细胞裂解、离心、柱层析等，最终获得高纯度的 Lon 蛋白酶，用于后续实验。
5. 肽分析：采用 PierceTM BCA 肽检测试剂盒对细菌中的肽进行定量分析。样品用冰冷的氯仿 / 甲醇 / 水（1:3:1）按 1:5 的比例稀释，在 4°C、1000rpm 条件下孵育 1 小时，离心后取上清液储存于 - 80°C。利用液相色谱（LC） - 离子淌度（IM） - 四极杆飞行时间（qTOF）质谱联用技术对氨基酸、二肽和三肽进行分析，通过复杂的数据处理和分析流程，实现对肽的准确鉴定和定量。

研究结果

1. Lon 蛋白酶增加死后营养循环：研究人员通过实验发现，不同基因型死细菌的裂解物对活大肠杆菌的生长促进作用存在差异。野生型大肠杆菌 BW25113（WT）的裂解物能显著促进活大肠杆菌的生长，而大肠杆菌 BL21（缺失 Lon 和 OmpT 蛋白酶编码基因）的裂解物则不能。进一步研究发现，大肠杆菌 BW25113 Δlon（Lon - null）的裂解物也无法促进活细胞生长，而大肠杆菌 BW25113 ΔompT（OmpT - null）的裂解物可以。这表明 Lon 蛋白酶在死后营养循环中发挥着重要作用，而不是 OmpT 蛋白酶。研究人员还排除了 Lon - null 裂解物中积累抑制生长的有毒分子的可能性，推断细菌利用死细菌释放的大分子物质生长，依赖于死亡后表现出的 Lon 蛋白酶活性这一表型。
2. Lon 蛋白酶的蛋白水解活性而非 ATP 酶活性是死后营养循环所必需的：Lon 蛋白酶单体包含 N - 末端结构域、AAA + ATP 酶模块和 C - 末端丝氨酸蛋白酶结构域，其在细胞内的蛋白降解过程通常依赖 ATP 水解。研究人员通过构建携带不同突变的 Lon 蛋白酶的质粒，对 Δlon 细胞进行互补实验。结果发现，补充具有蛋白酶活性缺陷（S679A；protease - null）或蛋白酶和 ATP 酶活性均缺陷（S679A/K362Q；protease/ATPase - null）的 Lon 蛋白酶的裂解物，无法挽救 Lon - null 的表型；而补充 ATP 酶活性缺陷（K362Q；ATPase - null）的 Lon 蛋白酶的裂解物可以挽救该表型。这表明 Lon 蛋白酶在死后促进生长的作用是不依赖 ATP 的，与它在活细胞中依赖 ATP 的作用形成对比。此外，通过 FITC - 酪蛋白检测实验发现，只有含有功能性 Lon 蛋白的细菌裂解物才具有可测量的蛋白酶活性，进一步证实了 Lon 蛋白酶的蛋白酶活性与死后生长促进能力相关。
3. Lon 蛋白酶在死后营养循环中的作用不具有物种特异性：为了排除实验中活细胞产生的 Lon 蛋白酶对实验结果的影响，研究人员使用 Lon - null 细胞作为活培养物进行实验，结果与使用 WT 细胞作为活培养物时一致，说明 Lon 蛋白酶在死后营养循环中的作用与活细胞是否产生 Lon 蛋白酶无关。研究人员还以枯草芽孢杆菌作为活培养物进行实验，发现来自死细菌的 Lon 蛋白酶对枯草芽孢杆菌生长的促进作用与对大肠杆菌的作用相同，表明 Lon 蛋白酶的这种作用不局限于大肠杆菌，不具有物种特异性。
4. Lon 蛋白酶在死后发挥作用介导营养循环：虽然之前的实验表明 Lon 蛋白酶来自死细菌对活细胞生长有促进作用，但不能排除其在活细胞中也有作用的可能性。研究人员通过在细胞死亡后向 Lon - null 裂解物中添加纯化的重组 Lon 蛋白酶来补充其活性，发现添加野生型 Lon 蛋白酶或 ATP 酶缺陷型 Lon 蛋白酶可以挽救 Lon - null 裂解物的表型，而添加蛋白酶缺陷型或蛋白酶 / ATP 酶双缺陷型 Lon 蛋白酶则不能。这进一步证明 Lon 蛋白酶在营养循环中的作用主要发生在死后，且很可能不依赖于其在死亡前细胞中的存在。此外，研究人员还发现嗜热球菌（Thermococcus onnurineus）NA1 的 B 型 Lon 蛋白酶（TonLon）与大肠杆菌的 Lon 蛋白酶在挽救 Lon - null 裂解物表型方面效果相同，表明 Lon 蛋白酶的作用不具有物种或 Lon 类型特异性。
5. Lon 蛋白酶是死后营养循环中小肽产生所必需的：由于 Lon 蛋白酶在死后营养循环中的作用与蛋白酶活性相关，研究人员推测它能将高分子量的完整蛋白质分解为较小分子量的肽，以便被活细菌吸收利用。通过对细菌细胞内肽水平的检测发现，WT 和 Lon - null 细胞在 6 - 10 个氨基酸范围内的肽含量没有显著差异，但只有含有 Lon 蛋白酶的细胞在死后能够分解这些肽。进一步通过液相色谱 - 离子淌度 - 四极杆飞行时间质谱联用技术分析发现，WT 裂解物在死后 20 小时孵育后，923 种氨基酸、二肽和三肽的分布显著增加，而 Lon - null 裂解物则没有明显变化。对差异显著的前 30 种二肽和三肽分析表明，WT 组中 23 种的含量高于 Lon - null 组，这表明 Lon 蛋白酶在产生适合肽转运蛋白摄取的肽方面发挥着重要作用，为其在死后营养循环中的作用提供了进一步证据。
6. Lon 蛋白酶似乎是一种死后的社会适应性产物：研究人员探究了自然选择为何会青睐 Lon 蛋白酶这种死后表型。研究发现，Lon 蛋白酶通过将蛋白质分解为二肽和三肽，为周围细胞提供营养，促进其生长，是一种合作性的公共物品。然而，产生 Lon 蛋白酶是有代价的，在生长早期（37°C，在基本培养基中培养 20 小时，处于早期稳定期），Lon - null 突变细胞的生长密度高于产生 Lon 蛋白酶的 WT 细胞和 Lon - null 细胞（携带编码 Lon 蛋白酶的质粒），这表明产生 Lon 蛋白酶会带来适应性成本。此外，在混合培养实验中，不产生 Lon 蛋白酶的细胞（Lon - null）在 5 天的培养过程中频率从 3% 增加到 12%，说明它们能够利用 WT 细胞产生的 Lon 蛋白酶，即 Lon 蛋白酶的产生可被 “作弊者” 利用 。在压力条件下（42°C 热激处理），Lon 蛋白酶的产生能为活细胞提供直接的私人利益，如通过蛋白质质量控制促进细胞生长。但在实验条件下，这种私人利益并不能完全抵消产生 Lon 蛋白酶的成本，非产生 Lon 蛋白酶的突变细胞（Lon - null）在混合培养中仍能增加其种群频率。不过，热激条件下 “作弊者” 利用生产者的能力降低，且这种利用能力与起始培养物中 “作弊者” 的比例无关，这使得亲缘选择更容易解释 Lon 蛋白酶的产生，因为与纯粹的利他合作性状相比，它对亲缘关系的要求更低。

研究结论与讨论

该研究揭示了细菌中 Lon 蛋白酶在死后蛋白质分解和营养循环中的关键作用，这是一种此前未被充分认识的死后生物化学机制。Lon 蛋白酶由死细菌释放，能够将蛋白质分解为小肽，为活细菌提供营养，促进其生长，这一过程是一种合作性的社会适应行为，可能部分由亲缘选择所解释 。尽管 Lon 蛋白酶在压力条件下也能为活细胞提供私人利益，但在研究的实验条件下，这种私人利益无法完全抵消其产生的成本。

这项研究的意义不仅局限于微生物营养循环领域，还为理解更广泛的生物学现象提供了新的思路。例如，在其他单细胞生物（如单细胞绿藻）中，细胞死亡方式会影响其细胞内容物对其他活细胞相对生长速率的作用；在植物领域，叶片凋落物的可分解性可能受到自然选择的影响，因为它会影响土壤肥力，进而对植物自身有益；在动物研究中，小鼠和斑马鱼死后的基因转录谱呈现出明显的有序成分，尽管其机制尚不清楚 。由此推测，许多物种可能都存在受自然选择青睐的死后表型。这一研究为进一步探索生物死后的生理过程及其在生态系统中的作用奠定了基础，有望推动多学科领域对生物死后现象的深入研究，帮助我们更好地理解生物在整个生命周期中与环境的相互作用。