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为解决水稻孕穗期耐寒性相关基因及机制不明的问题，研究人员开展了水稻孕穗期耐寒性的研究。他们鉴定出 CTB3 基因，明确其调控机制及相关通路，发现有利等位基因被选择。这为水稻耐寒育种提供了重要靶点。
水稻作为全球重要的粮食作物，起源于热带，对低温较为敏感。在高海拔和高纬度地区，低温成为水稻生产的严重威胁，尤其是孕穗期遭受低温，会导致小穗不育、结实率降低，进而造成产量的直接损失。例如，在中国，每年因秋季低温估计会损失 300 - 500 万吨水稻产量。尽管此前对水稻早期生长阶段的耐寒性研究已取得一定成果，但孕穗期耐寒性的分子机制仍有待深入探索，相关基因的研究也较少。在此背景下，中国农业大学等研究机构的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员运用了多种关键技术方法。通过 CRISPR/Cas9 技术构建基因敲除突变体，以探究基因功能；利用 RNA 测序（RNA-seq）技术筛选差异表达基因，挖掘 CTB3 下游调控基因；借助酵母单杂交（Y1H）、染色质免疫沉淀 - 定量 PCR（ChIP-qPCR）和电泳迁移率变动分析（EMSA）等技术验证蛋白与 DNA 的相互作用；还通过构建近等基因系、进行基因编辑等操作研究基因的遗传效应。研究样本包括多种水稻品种，如耐寒的日本晴（Nipponbare，Nip）、冷敏感的特青（Teqing，TQ）等。
CTB3 正向调控水稻孕穗期耐寒性
研究人员在前期研究中发现了与水稻孕穗期耐寒性相关的位点 qCTB1t，并通过 CRISPR/Cas9 技术获得了候选基因的单敲除突变体。实验表明，Os01g0923600（命名为 CTB3）敲除突变体在冷胁迫下结实率低于 Nip，而 Os01g0923800 敲除突变体与 Nip 无差异。进一步研究发现，CTB3-Hap1 单倍型在冷胁迫下表现出更高的结实率，且主要存在于粳稻品种中。将 CTB3-Hap1 的互补构建体导入冷敏感的 TQ 中，以及在 Nip 中过表达 CTB3，均能提高水稻在冷胁迫下的结实率。此外，研究还发现 CTB3 在调控水稻苗期耐寒性方面也发挥作用，并且通过影响花药和花粉的发育来增强孕穗期的耐寒性。
CTB3 的表达模式和亚细胞定位
组织表达分析显示，CTB3 在水稻不同组织和发育阶段均有表达，且在冷处理后表达迅速上调。亚细胞定位实验表明，CTB3 定位于细胞核，酵母双杂交和荧光素酶实验证明其具有自激活活性，转录激活实验确定其转录激活域位于 N 端 136 - 306 aa。
CTB3 启动子区的两个插入缺失（indels）赋予水稻耐寒性
对 CTB3 序列分析发现，99.45% 的籼稻品种在 CTB3 启动子区域含有 57-bp 和 284-bp 序列，而 87.1% 的粳稻品种缺失这两个序列。候选基因关联分析表明，这两个 indels 与孕穗期耐寒性密切相关。瞬时表达实验显示，删除这两个序列可提高 CTB3 启动子活性，且 CTB3-Hap1 在冷诱导下的表达水平显著高于 CTB3-Hap2。通过构建近等基因系和基因编辑获得的转基因株系也进一步验证了这两个 indels 对 CTB3 表达和水稻耐寒性的重要作用。
OsTCP19 在 CTB3 上游负向调控孕穗期耐寒性
序列分析发现，CTB3 启动子区的 57-bp 和 284-bp 序列存在与 TCP 家族转录因子结合的潜在基序，其中 OsTCP19 与 CTB3 启动子的结合能力最强。研究发现，OsTCP19 在所有组织中均有表达，且其表达受冷下调。敲除 OsTCP19 可提高 CTB3 的冷诱导表达水平，而过表达 OsTCP19 则抑制 CTB3 表达。多种实验手段证明，OsTCP19 直接结合到 CTB3 启动子的结合位点上，抑制其表达。此外，OsTCP19 敲除突变体在冷胁迫下的结实率高于 Nip，而过表达株系的结实率低于 Nip，表明 OsTCP19 负向调控孕穗期耐寒性。双敲除突变体实验表明，CTB3 可能位于 OsTCP19 的下游，参与同一遗传途径调控孕穗期耐寒性。
OsTPP1 是 CTB3 的直接靶基因，正向调控孕穗期耐寒性
通过对 CTB3 敲除突变体和 Nip 进行 RNA-seq 分析，研究人员发现了 1020 个差异表达基因，其中 OsTPP1 在碳水化合物代谢过程中起关键作用。Y1H 实验、ChIP-qPCR 实验、EMSA 实验和荧光素酶活性实验等表明，CTB3 直接结合到 OsTPP1 启动子上，正向调控其表达。敲除 OsTPP1 会降低水稻在冷胁迫下的结实率，影响花粉发育，而过表达 OsTPP1 可挽救 CTB3 敲除突变体的耐寒性表型，说明 CTB3 和 OsTPP1 在同一遗传途径中调控孕穗期耐寒性。
CTB3 通过调节水稻糖供应赋予耐寒性
OsTPP1 编码海藻糖 - 6 - 磷酸磷酸酶 1，可将海藻糖 - 6 - 磷酸（Tre6P）去磷酸化为海藻糖（Tre）。研究发现，CTB3 过表达株系中 Tre6P 含量降低，而 CTB3 敲除突变体和 OsTPP1 敲除突变体中 Tre6P 含量升高。同时，CTB3 过表达株系中糖转运相关基因（STG）表达上调，糖积累增加；而在 CTB3 敲除突变体和 OsTPP1 敲除突变体中，STG 基因表达下调，糖积累减少。外施 Tre6P 会降低 CTB3 过表达株系的耐寒性，表明 CTB3 通过激活 OsTPP1 表达，降低 Tre6P 含量，影响糖积累，从而保护花粉发育和育性，提高水稻孕穗期耐寒性。
CTB3 在温带粳稻驯化过程中受到选择
对 CTB3 等位基因的地理分布分析显示，CTB3-Hap1 主要分布在北方地区，而 CTB3-Hap2 主要分布在南方低纬度地区。通过对野生稻和栽培稻的序列分析及系统发育树构建，发现 CTB3 在野生稻中已发生分化，且在温带粳稻驯化过程中受到正向选择，这有助于粳稻适应寒冷气候。
OsTCP19 在粳稻驯化过程中受到选择
对 OsTCP19 进行单倍型分析发现，T-Hap1 为耐寒单倍型，主要存在于粳稻中，可能直接起源于野生稻 O. rufipogon III。地理分布分析表明，T-Hap1 主要分布在东北、华北以及日本和朝鲜等寒冷地区。核苷酸多样性分析和中性检验显示，OsTCP19 在粳稻中受到正向选择，在籼稻中可能受到平衡选择，说明 T-Hap1 被选择保留在粳稻中，有助于提高粳稻的耐寒性。
OsTCP19 和 CTB3 共同促进水稻耐寒性的提高
联合单倍型分析表明，含有 OsTCP19 和 CTB3 两个有利等位基因的组合（Group I）在粳稻中表现出最高的结实率，CTB3-Hap1 进一步促进了粳稻亚种内耐寒性的提高。对两个基因的进化关系分析发现，它们的有利单倍型可能在野生稻中起源，并在粳稻适应寒冷气候的过程中被选择和保留。在育种过程中，OsTCP19 和 CTB3 的有利等位基因频率在粳稻改良品种中增加，表明它们在提高粳稻耐寒性和促进水稻向高纬度地区扩展中发挥了重要作用。
研究结论表明，CTB3 作为钙调蛋白结合转录激活因子（CAMTA）家族成员，正向调控水稻孕穗期耐寒性。CTB3 启动子区的两个 indels 是关键功能变异，影响其表达水平。OsTCP19 通过结合 CTB3 启动子抑制其表达，负向调控耐寒性；而 CTB3 激活 OsTPP1 表达，通过调节 Tre6P 含量和糖代谢相关基因的表达，增强水稻的耐寒性。此外，CTB3 和 OsTCP19 的有利等位基因在粳稻驯化和育种过程中受到选择，对粳稻适应寒冷环境具有重要意义。
该研究不仅揭示了水稻孕穗期耐寒性的分子机制，还为水稻耐寒育种提供了重要的理论基础和潜在的基因靶点。通过对这些基因的深入研究和利用，有望培育出更耐寒的水稻品种，减少低温对水稻生产的影响，保障粮食安全。
