卢旺达基加利临床患者中弯曲杆菌抗生素耐药性的高流行态势及深度剖析

为填补卢旺达 Campylobacter 研究数据空白，卢旺达大学的研究人员开展 “基加利临床患者中耐药 Campylobacter 流行情况” 研究，发现其感染率高且耐药严重。该研究对防控感染、合理用药意义重大，推荐科研读者阅读。

　　

卢旺达大学科学与技术学院生物学系（Biology Department, School of Science, College of Science and Technology, University of Rwanda）的 Noel Gahamanyi 等人在《BMC Infectious Diseases》期刊上发表了题为 “High prevalence of antibiotic resistant Campylobacter among patients attending clinical settings in Kigali, Rwanda” 的论文。该研究聚焦于卢旺达基加利临床环境中弯曲杆菌（Campylobacter）的抗生素耐药情况，对于了解非洲地区弯曲杆菌感染现状、防控相关疾病以及应对抗生素耐药问题具有重要意义。

研究背景

弯曲杆菌是一类革兰氏阴性螺旋菌，能引发人类肠胃炎。其中，空肠弯曲杆菌（C. jejuni）和结肠弯曲杆菌（C. coli）是导致人类肠胃炎的主要菌种 ，它们广泛分布于家禽和野生动物肠道中，家禽更是人类感染的主要来源。这类细菌对温度有特殊要求，嗜热弯曲杆菌在 37 - 42°C 之间生长，最适温度为 41.5°C。

在低收入和中等收入国家（LMICs），由于实验室诊断能力有限以及对肠道疾病监测不足，关于嗜热弯曲杆菌的研究较为匮乏。在撒哈拉以南非洲地区（SSA），弯曲杆菌在人和动物中的流行率差异较大，分别为 1.7 - 62.7% 和 1.2 - 80%。该地区的农业活动、牲畜养殖、水质和卫生设施等因素都可能促使弯曲杆菌传播。

弯曲杆菌感染的症状包括水样或血性腹泻、腹痛、发热和恶心等，还可能引发克罗恩病（Crohn’s disease）、米勒 - 费雪综合征（Miller - Fisher syndrome）和格林 - 巴利综合征（Guillain–Barré syndrome）等并发症。虽然弯曲杆菌感染通常具有自限性，但严重病例和免疫功能低下人群仍需抗生素治疗。然而，人类和兽医学中抗生素的滥用，使得弯曲杆菌对抗生素的耐药性不断增强，尤其是对氟喹诺酮类药物。世界卫生组织（WHO）已将耐氟喹诺酮类弯曲杆菌列为开发新型抗生素的高优先级病原体。

在卢旺达，关于弯曲杆菌及其抗菌药物敏感性的研究数据十分有限。此前的研究主要集中在五岁以下儿童和流产组织中弯曲杆菌的检测，以及从农场蔬菜和灌溉水中分离弯曲杆菌，尚未有研究评估其抗菌药物敏感性。因此，开展此项研究对于填补该地区在这一病原体研究方面的数据空白至关重要。

研究方法

1. 研究设计与样本量估算：采用横断面研究设计，运用目的抽样法确定样本量。根据 Thrusfield（1995）公式计算，在 95% 置信区间（CI）、期望精度（d）为 0.05 的条件下，确定样本量为 385。
2. 研究区域与时间：研究在卢旺达基加利尼亚鲁根杰区（Nyarugenge district）的两所医院（基加利大学教学医院 CHUK 和尼亚鲁根杰区医院 Nyarugenge DH）和两所健康中心（穆希马健康中心 Muhima HC 和比里约戈健康中心 Biryogo HC）进行，时间为 2024 年 3 月至 6 月。
3. 样本、人口统计学和临床数据收集：从上述健康设施中患有肠胃炎症状的患者处收集粪便样本，无论年龄、性别和居住地点。每个患者收集约 2 - 5g 粪便，置于粪便容器中，在 4 小时内用冰袋运送至实验室。同时记录患者的人口统计学信息（年龄、性别、临床就诊地点）和临床特征（发热、腹部不适和腹泻）。
4. 弯曲杆菌分离：样本到达实验室后，先在添加了弯曲杆菌生长补充剂 SR0232E、改良普雷斯顿弯曲杆菌选择性补充剂 SR0204E 和 5% 脱纤维羊血的普雷斯顿肉汤（Preston Broth）中进行预富集，然后在微需氧环境（由 CampyGen?产气袋在厌氧罐中产生）下 37°C 孵育 24 小时。富集后的样本划线接种到添加了 SR155E 的改良木炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（mCCDA）上，同样在微需氧条件下 37°C 孵育 48 小时。疑似弯曲杆菌菌落再接种到添加 5% 脱纤维羊血的血琼脂上，37°C 微需氧孵育 48 小时。通过革兰氏染色、过氧化氢酶和氧化酶试验对疑似阳性菌落进行初步鉴定，再用聚合酶链反应（PCR）进行确认。确认后的弯曲杆菌分离株保存在添加 25% 甘油的穆勒 - 欣顿肉汤（Mueller Hinton Broth）中，置于 - 80°C 保存。
5. 抗菌药物敏感性测试：采用纸片扩散法，在添加 5% 脱纤维羊血的穆勒 - 欣顿琼脂（MHA）上进行抗菌药物敏感性测试（AST），遵循临床和实验室标准协会（CLSI）的指南。选用 6 种抗生素，包括 5μg 环丙沙星（CIP）、15μg 红霉素（ERY）、10μg 链霉素（STR）、30μg 四环素（TET）、10μg 庆大霉素（GEN）和 30μg 氯霉素（CHL），评估分离株的 AST 谱。将保存的弯曲杆菌分离株在血琼脂上复苏并传代培养，获得不含甘油的纯菌落。将纯菌落悬浮在无菌生理盐水中，调整浊度至 0.5 麦氏标准。用无菌玻璃涂布器将菌悬液均匀涂布在 MHA 平板上，待平板干燥后，用镊子将抗生素纸片均匀分布在平板上，确保纸片间距至少 24mm。平板在 37°C 微需氧环境下孵育 48 小时，孵育后用直尺测量抑菌圈大小，根据 CLSI 标准判断结果。对三种或更多类抗生素耐药被定义为多重耐药（MDR）。
6. DNA 提取和多重 PCR 物种确认：将保存的弯曲杆菌分离株在添加 5% 脱纤维羊血的血琼脂上复苏，37°C 微需氧孵育 48 小时，再进行传代培养获得纯菌落用于 DNA 提取。使用 Zymo Research Quick - DNA Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit 提取基因组 DNA，用 Quantus?荧光计定量，用分光光度计评估 DNA 质量，提取的 DNA 保存于 - 20°C 直至进行 PCR。采用多重 PCR，使用属特异性引物（C412F 和 C1228R）、空肠弯曲杆菌 cj0414 基因引物（C1 和 C3）和结肠弯曲杆菌 ask 基因引物（CC18F 和 CC519R）进行物种确认。PCR 反应体系为 25μl，包括 12.5μl 的 2X Master Mix、1μl 引物（10μM）、1.5μl 模板 DNA（20μg/ml）和 7μl 无菌去离子水。反应条件为 95°C 预变性 5 分钟，然后进行 35 个循环，每个循环包括 94°C 变性 30 秒、60°C 退火 45 秒、72°C 延伸 45 秒，最后 72°C 延伸 7 分钟。PCR 产物在 4°C 保存，待分析时进行凝胶电泳，将扩增产物条带与 NEB 100bp DNA ladder 对比观察。
7. 数据分析：使用 Microsoft Excel 记录阳性率和抗菌药物敏感性数据的初步结果，用直尺测量抑菌圈并按照 CLSI 指南进行解释。运用 IBM SPSS version 27 软件进行描述性统计分析（计算患病率、抗生素耐药比例和不同属性的频率），采用卡方检验评估临床症状（腹泻、发热和腹部不适）、人口统计学因素（年龄、性别和健康设施）与弯曲杆菌感染之间的关联，检验在 95% 置信水平下进行，显著性阈值设定为 α = 0.05。

研究结果

1. 患者的社会人口统计学特征：共收集了 385 份人类粪便样本，其中 63.1% 来自比里约戈健康中心，16.4% 来自尼亚鲁根杰区医院，15.1% 来自穆希马健康中心，5.5% 来自基加利大学教学医院。女性占比 61.8%，男性占比 38.2%。参与者中，47% 的人年龄在 17 - 50 岁之间，21.8% 的人年龄在 6 - 16 岁之间。
2. 嗜热弯曲杆菌的总体患病率：弯曲杆菌的总体患病率为 7.01%（27/385）。比里约戈健康中心的患病率最高，达 77.8%（21/27），尼亚鲁根杰区医院和穆希马健康中心分别为 14.8%（4/27）和 7.4%（2/27），基加利大学教学医院未分离出弯曲杆菌。在阳性样本中，女性占 63%（17/27），男性占 7%（10/27）。大多数阳性病例年龄在 50 岁以上，5 岁以下儿童中弯曲杆菌的患病率为 18.5%（5/27）。通过 PCR 确认，27 株分离株中 92.6%（25/27）为空肠弯曲杆菌，7.4%（2/27）为结肠弯曲杆菌。
3. 弯曲杆菌感染的相关因素：分析发现，人口统计学因素（性别、年龄和采样地点）与感染无显著关联（p 值 > 0.05），而临床症状（腹泻和腹痛）与感染显著相关（p 值 < 0.05）。不过，在多变量回归分析中，感染与宿主腹痛之间的正相关关系未达到统计学显著性。
4. 抗菌药物敏感性测试：所有嗜热弯曲杆菌分离株对 6 种抗菌药物进行测试，总体上只有 47.9% 的分离株对测试抗生素敏感。分离株对链霉素耐药率最高，达 85.2%（23/27），其次是红霉素 66.7%（18/27）和环丙沙星 37.1%（10/27）。此外，100%（27/27）的分离株对至少一种抗生素耐药，92.6%（25/27）的分离株对至少两种抗生素耐药，多重耐药（MDR）比例为 66.7%（18/27）。37%（10/27）的分离株对四种抗生素耐药，22.2%（6/27）的分离株对五种抗生素耐药，有 1 株分离株对所有 6 种测试抗生素均耐药。进一步按年龄和性别评估抗生素耐药水平，发现女性耐药率更高，为 59.3%（16/27），男性为 40.7%（11/27）。男性中，[0 - 5] 岁和 [18 - 44] 岁年龄组耐药情况较为突出；女性中，[18 - 44] 岁年龄组耐药现象明显。比里约戈健康中心的耐药率最高，达 77.8%（21/27），尼亚鲁根杰区医院和穆希马健康中心分别为 14.8%（4/27）和 7.4%（2/27）。

研究结论与讨论

该研究首次对卢旺达临床环境中嗜热弯曲杆菌的患病率和抗菌药物敏感性进行了评估。研究结果显示，弯曲杆菌感染在基加利市较为普遍，且与腹泻密切相关。比里约戈健康中心所在地区人口密集，粪便污泥管理有限，这为粪 - 口传播的弯曲杆菌提供了适宜的传播条件，导致该地区感染率较高。

在抗菌药物敏感性方面，弯曲杆菌对常用抗生素如红霉素和链霉素表现出较高的耐药性。红霉素作为治疗弯曲杆菌感染的首选药物，其耐药性的增加对公共卫生构成了重大威胁。这可能导致治疗失败，使手术、器官移植和癌症治疗等过程面临更高风险，影响患者的治疗效果和疾病预后。此外，多重耐药弯曲杆菌的出现也不容忽视，其较高的耐药率警示人们需要加强对抗菌药物使用的监管和监测。

虽然本研究存在一定局限性，如地理覆盖范围有限、采用目的抽样法且样本量相对较小，无法推断全国的感染情况；横断面研究设计无法确定因果关系；纸片扩散法不能准确测定最低抑菌浓度（MIC）等。但该研究为卢旺达弯曲杆菌感染和耐药情况提供了重要的基础数据，凸显了将弯曲杆菌检测纳入临床常规诊断的必要性。

为应对弯曲杆菌感染和耐药问题，建议开展全国范围内人和动物的弯曲杆菌抗菌药物耐药性评估，建立抗菌药物耐药监测系统，严格遵守国家抗菌药物管理指南，加强健康教育和社区宣传，提高公众对弯曲杆菌感染和抗菌药物耐药性的认识。同时，进一步开展弯曲杆菌基因组测序研究，有助于深入了解流行菌株和耐药机制，为制定更有效的防控策略提供依据。

这项研究对于卢旺达乃至整个非洲地区防控弯曲杆菌感染、合理使用抗生素以及保障公众健康具有重要的指导意义，为后续研究和公共卫生干预措施的制定奠定了坚实基础。