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为探究椎间盘退变（IVDD）中基质硬度对髓核细胞（NPCs）糖酵解的影响机制，苏州大学附属第二医院的研究人员开展相关研究。结果发现 MRTF-A 是关键调节因子。该研究为 IVDD 治疗提供新靶点，强烈推荐科研读者阅读。
苏州大学附属第二医院骨科（Department of Orthopedic Surgery, The Second Affiliated Hospital of Soochow University）的研究人员 Haoran Xu 等人在《Bone Research》期刊上发表了题为 “Matrix stiffness regulates nucleus pulposus cell glycolysis by MRTF-A-dependent mechanotransduction” 的论文。这篇论文在椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration，IVDD）研究领域意义重大，为理解椎间盘退变机制和寻找潜在治疗靶点提供了新的方向。
研究背景
椎间盘退变在人群中愈发常见，它与衰老、过载、肥胖等多种因素相关。其进展会引发如腰痛、椎间盘突出、椎管狭窄和肢体麻痹等一系列症状，严重影响患者生活质量，还带来沉重经济负担。目前传统的药物和手术治疗主要是缓解腰痛症状，无法针对根本病因，且存在复发和病情进展的风险。
椎间盘由髓核（nucleus pulposus，NP）、纤维环和软骨终板组成。NP 组织的退变是 IVDD 过程中的主要病理变化。NP 组织所处的生理环境特殊，处于缺氧、酸性且封闭状态，其主要营养物质从周围血管扩散而来。在这种环境下，无氧糖酵解是髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要能量来源 。NPCs 退变时会出现葡萄糖供应不足、乳酸积累和糖酵解减少的情况，这又会反过来加重 NPCs 退变和代谢功能障碍。然而，目前对于退变 NPCs 中异常糖酵解的调控机制仍有待进一步深入研究。
大量研究发现，退变的 NP 组织具有细胞外基质（extracellular matrix，ECM）硬度增加的特征，这主要是由于 NPCs 中胶原蛋白、蛋白聚糖和复合糖蛋白的合成与分解代谢功能失调，导致正常基质解体和纤维基质形成。近期研究表明，ECM 硬度增加会通过激活机械转导信号通路，引起上皮细胞和肿瘤细胞的糖酵解异常。但在 IVDD 进展过程中，NP 组织的硬度增加是否会调节糖酵解尚不清楚。
细胞对 ECM 硬度变化的机械转导过程，是由细胞膜上的整合素 - 粘着斑复合物感知，然后将信号传递到细胞内，细胞质中的机械信号还能传递到细胞核，进而激活下游通路。心肌相关转录因子 A（Myocardin-related transcription factor A，MRTF-A）是硬度信号机械转导中的重要介质，主要对细胞骨架重塑信号作出反应。它作为血清反应因子（serum response factor，SRF）转录因子的强效共激活剂，能与血清反应元件（serum-response elements，SREs）结合，调节影响细胞分化、ECM 重塑和纤维化的转录过程。鉴于 MRTF-A 在基质硬度机械转导中的作用，以及基质硬度与糖酵解之间可能存在的联系，研究人员推测 MRTF-A 可能是 ECM 硬度与糖酵解之间的调节因子。
研究方法
- 实验试剂与动物：研究使用了多种试剂，如 CCG - 203971（CCG）、细胞松弛素 D（Cytochalasin D，CD）等，这些试剂均购自 MedChemExpress 公司。还构建了多种病毒载体，包括 MRTF-A 过表达腺病毒（OE-MRTF-A）等，由 Vigene Biosciences 公司完成。实验动物选用 6 - 8 周龄、体重 200 ± 20g 的雄性 Sprague - Dawley 大鼠，饲养于特定条件下，所有动物实验符合相关伦理规定并获得批准。
- NPCs 的分离、培养和处理：从大鼠尾椎间盘获取 NP 组织，经胰蛋白酶和 II 型胶原酶消化后，在特定培养基中培养 NPCs。通过梯度实验确定了 CCG、GSK621（GSK）和 Dorsomorphin（Dor）等试剂在 NPCs 实验中的浓度和作用时间。利用病毒载体对 NPCs 进行转染处理，以研究相关基因的功能。
- 人 NP 组织的收集和硬度检测：从接受腰椎间盘切除术的患者中收集 NP 组织，分为正常组和 IVDD 组。经患者和伦理委员会批准后，制备标准样本，使用原子力显微镜检测 NP 组织的硬度。
- 聚丙烯酰胺水凝胶的制备：通过改变丙烯酰胺和双丙烯酰胺的相对浓度，制备不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶，并将牛 II 型胶原蛋白共价结合到水凝胶底物上。NPCs 在不同硬度的水凝胶上培养 24 小时后，用于后续实验。
- 多种检测分析方法：运用蛋白质免疫印迹法（Western blot analysis）检测 NP 组织和细胞中的蛋白质表达水平；采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技术研究蛋白质之间的相互作用；通过双荧光素酶报告基因检测（Dual-luciferase assay）分析基因转录活性；利用免疫荧光（Immunofluorescence，IF）实验观察细胞内蛋白的定位和表达；运用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR analysis）检测基因的 mRNA 表达水平；借助染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）实验探究蛋白质与 DNA 的结合情况。此外，还构建了 IVDD 大鼠模型，通过磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、Micro-CT 和 X 射线等技术对大鼠 IVD 组织进行成像分析，结合组织学染色和免疫组化（IHC）实验评估组织形态和蛋白表达变化。利用气相色谱 - 质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析细胞代谢物，检测糖酵解指标来评估 NPCs 的糖酵解功能。
研究结果
- 增加的基质硬度抑制 NPCs 的糖酵解：通过 T2 加权 MRI 和组织硬度检测发现，IVDD 患者的 NP 组织硬度显著增加。免疫组化染色显示，退变 NP 组织中参与糖酵解和葡萄糖摄取过程的关键酶磷脂酶 D1（PLD1）、磷酸果糖激酶 - 1（PFKM）和 6 - 磷酸果糖 - 2 - 激酶 / 果糖 - 2,6 - 二磷酸酶 3（PFKFB3）表达下降。在体外实验中，构建软（0.5 kPa）和硬（20 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶培养 NPCs，发现硬基质上培养的 NPCs 呈现多边形且无空泡的形状，同时其主要软骨细胞标记物 II 型胶原蛋白（Col2a1）和聚集蛋白聚糖（Acan）表达减少，纤维标记物 I 型胶原蛋白（Col1a1）表达增加，表明 NPCs 出现退变表型。硬基质还降低了 NPCs 中 PLD1、PFKM 和 PFKFB3 的表达，减少了 ATP、乳酸和丙酮酸的产生，抑制了葡萄糖的消耗。这些结果表明，增加的基质硬度会损害 NPCs 的糖酵解过程。
- 基质硬度激活 MRTF-A 促进 NPCs 退变：对在软、硬基质上培养的 NPCs 进行 RNA 测序，GO 富集分析显示硬基质改变了 NPCs 中与细胞骨架相关的生物学过程。鬼笔环肽染色表明硬基质促进了 NPCs 的细胞骨架重塑，同时 MRTF-A 在硬基质条件下表达增加并发生核转位。在 IVDD 患者和大鼠模型的 NP 组织中，MRTF-A 的表达也显著上调。使用细胞松弛素 D 抑制细胞骨架重塑，可有效抑制 MRTF-A 的核转位，并部分挽救硬基质诱导的 NPCs 退变表型。过表达 MRTF-A 会导致 NPCs 中 Col1a1 和分解代谢标记物（MMP3 和 MMP13）表达增加，而软骨样元素（Col2a1 和 Acan）表达减少。使用 MRTF-A 抑制剂 CCG 处理，可抑制 MRTF-A 的核转位，恢复 Acan 和 Col2a1 的表达，减少 Col1a1、MMP3 和 MMP13 的表达，表明 MRTF-A 在 IVDD 进展过程中被上调，其激活会加剧 NPCs 的代谢功能障碍。
- MRTF-A 通过抑制 AMPK 通路降低 NPCs 的糖酵解：通过 GC-MS 分析发现，MRTF-A 过表达显著降低了 NPCs 中糖酵解产物（乳酸、丙酮酸和 ATP）的水平，而 CCG 处理则增加了这些产物的水平。KEGG 富集分析显示，糖酵解功能的变化与 AMPK 信号通路等多种代谢途径相关。进一步研究发现，硬基质抑制了 NPCs 中 AMPK 的磷酸化以及下游 PLD1、PFKM 和 PFKFB3 的表达，而 AMPK 激动剂 GSK 处理可部分挽救 NPCs 的糖酵解功能。在 NPCs 中过表达 MRTF-A 会抑制 AMPK 的磷酸化，降低 PLD1、PFKM 和 PFKFB3 的表达；CCG 则以剂量依赖的方式激活 AMPK 的磷酸化，上调这些糖酵解酶的表达。然而，AMPK 抑制剂 Dor 会降低 CCG 处理引起的 AMPK 磷酸化和糖酵解酶的上调。此外，抑制细胞骨架重塑可维持 AMPK 的磷酸化，表明细胞骨架重塑和随后的 MRTF-A 激活与糖酵解受损有关。虽然 MRTF-A 与 AMPK 之间存在调节关系，但 ChIP 结果表明 MRTF-A 不能直接调节 AMPK 的转录过程。
- MRTF-A 通过降低 Kidins220 的表达抑制 AMPK 磷酸化并减少糖酵解：分析 RNA 测序数据发现，CCG 处理的 NPCs 中，与钾通道蛋白表达和 ATP 产生相关的 Kidins220 基因表达显著增加，且 MRTF-A 的活性与 Kidins220 的基因表达呈负相关。ChIP 分析显示 MRTF-A 与 Kidins220 的启动子结合，荧光素酶分析表明 CCG 处理可直接促进 Kidins220 的转录。在蛋白水平上，CCG 和 CD 处理可促进硬基质条件下 Kidins220 的蛋白表达，而 MRTF-A 过表达则降低其表达。内源性 Co-IP 实验表明 Kidins220 与 AMPK 相互作用，CCG 可增强这种相互作用。过表达 Kidins220 可促进 AMPK 的磷酸化，增加糖酵解酶的表达；而敲低 Kidins220 则部分降低了 CCG 处理诱导的 AMPK 磷酸化和糖酵解。综上所述，激活的 MRTF-A 通过抑制 Kidins220 的表达，进而抑制 AMPK 的磷酸化和糖酵解过程。
- NP 组织中 MRTF-A 过表达加速 IVDD 进展：将 AAV-MRTF-A 注射到大鼠 NP 组织中，发现 NP 组织中 MRTF-A 的表达显著增加。MRI 分析显示，与对照组相比，注射 AAV-MRTF-A 的大鼠椎间盘信号密度降低，Pfirrmann 分级升高。X 射线扫描和 Micro-CT 3D 重建表明椎间盘高度降低，骨赘增加。组织学染色显示 MRTF-A 过表达导致 NPCs 丢失、基质塌陷和纤维环裂隙形成。此外，AAV-MRTF-A 处理还增加了 NP 组织中 MMP13 的表达，降低了 Col2a1、糖酵解酶和 Kidins220 的表达。这些结果表明，MRTF-A 过表达参与了 IVDD 的发生和发展。
- 抑制 MRTF-A 可部分缓解 IVDD 进展：构建 IVDD 大鼠模型并给予 MRTF-A 抑制剂 CCG 处理。成像评估显示，CCG 部分挽救了穿刺诱导的椎间盘结构塌陷和退变表型。组织学分析表明，CCG 减轻了 NP 组织的丢失和椎间盘的形态破坏。在蛋白水平上，CCG 处理降低了 MRTF-A 和 MMP13 的水平，增加了 Col2a1 的表达，同时部分增加了 Kidins220 的表达，恢复了 PLD1、PFKM 和 PFKFB3 的表达。这表明抑制 MRTF-A 可部分挽救 NPCs 的合成代谢和糖酵解功能，缓解 IVDD 的进展。
研究结论与讨论
本研究揭示了在 IVDD 进展过程中，基质硬度与糖酵解受损之间的机制联系，并确定 MRTF-A 是机械转导过程中的关键因素。退变 NP 组织中增加的基质硬度通过激活 MRTF-A，导致 NPCs 功能障碍和糖酵解减弱。相反，使用 CCG 抑制 MRTF-A 可在体外部分挽救 NPCs 的功能和糖酵解，并改善大鼠 IVDD 模型中的 NP 组织退变。从机制上讲，MRTF-A 主要通过降低 Kidins220 的表达和抑制 AMPK 的磷酸化来减少 NPCs 的糖酵解。
在许多组织中，异常的基质硬度会导致代谢功能障碍，包括糖、脂质和蛋白质代谢。在 IVDD 过程中，NP 组织硬度增加可被 NPCs 感知，进而调节蛋白质表达和信号转导，但此前其影响 NPCs 糖酵解的具体机制并不清楚。本研究填补了这一空白，发现增强的基质硬度会触发 MRTF-A 的核转位，从而减少 Kidins220 的转录和表达，抑制 AMPK 的激活和糖酵解。
MRTF-A 作为转录共激活剂，在多种生物过程中发挥重要作用，同时也是硬度机械转导的核心中继。以往研究发现它与 IVDD 进展中 NPCs 的纤维化表型有关，但具体机制不明。本研究通过 GC-MS 分析揭示了 MRTF-A 激活会导致糖酵解受损，这或许能解释硬度影响 NPCs 软骨表型和糖酵解的原因。此外，研究还优化了 CCG 的干预条件，采用新型二代抑制剂 CCG-203971，并结合腹腔注射的方式维持药物浓度，结果表明该治疗策略可有效抑制 MRTF-A 活性，改善 NP 组织退变且无明显副作用。
尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。目前针对 MRTF-A 的基因治疗和 CCG 治疗虽能挽救 NPCs 部分功能，但难以消除异常的 ECM 成分沉积和降低 NP 组织硬度，可能更适用于早期 IVDD 患者，且在临床应用中还面临给药方式和安全性等挑战。此外，如何定义细胞或组织中合适的糖酵解通量标准尚不明确，本实验对基质硬度机械转导的分析从 MRTF-A 激活开始，可能忽略了上游过程对 Kidins220 和 AMPK 的影响。
总的来说，本研究揭示了基质硬度与糖酵解在 IVDD 过程中的关联，强调了 MRTF-A 在其中的关键作用。MRTF-A 可能成为恢复糖酵解、延缓由 ECM 硬度增加引起的 IVDD 进展的重要靶点，为 IVDD 的治疗提供了新的理论依据和潜在治疗方向。未来研究可针对这些局限性进一步探索，以推动 IVDD 治疗的发展。
