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为解决不同非致死采样方法对蜥蜴肠道微生物群落分析的影响问题，洪都拉斯国立自治大学的研究人员开展相关研究。结果显示粪便样本在恢复 MAGs 和分析细菌群落方面更优。推荐阅读，助您深入了解动物微生物群落研究新进展。
洪都拉斯国立自治大学（Universidad Nacional Autónoma de Honduras）的 Mauricio Hernández 等人在《Animal Microbiome》期刊上发表了题为 “Contrasting recovery of metagenome-assembled genomes and derived bacterial communities and functional profiles from lizard fecal and cloacal samples” 的论文。这篇论文在动物微生物群落研究领域意义重大，为探究蜥蜴肠道微生物群落提供了新的视角，也为后续研究不同采样方法对微生物群落分析的影响奠定了基础，有助于更深入地理解动物与微生物之间的相互关系。
研究背景
微生物共生群落对许多动物的生态和进化起着基础性作用，因此研究肠道微生物群如何影响宿主健康和适应性备受关注。目前，分析微生物群落的两种主要方法是 16S rRNA 基因扩增子测序和鸟枪宏基因组测序。16S rRNA 测序虽常用于细菌和古细菌分类和定量，但无法直接提供微生物基因内容信息，限制了对代谢功能的推断。而基于鸟枪测序的基因组解析宏基因组学（GRM，genome-resolved metagenomics），能够通过重建宏基因组组装基因组（MAGs，metagenome-assembled genomes）直接获取细菌和古细菌的功能信息，在微生物群落功能评估和物种或菌株水平的分类鉴定方面具有优势，受到越来越多的关注。
在研究肠道微生物群落时，由于收集肠道内容物通常需要安乐死动物，研究人员常依赖粪便样本或直肠 / 泄殖腔拭子来替代。此前基于 16S rRNA 测序的研究表明样本类型对恢复微生物群落很重要，粪便微生物群与后肠微生物群相似，而泄殖腔微生物群可能是生殖和消化系统微生物的混合物，且粪便样本是评估肠道微生物群落的可靠替代物。不过，虽然 16S rRNA 测序在不同分类群中对样本类型影响的研究已较为充分，但基于 GRM 的类似研究较少。GRM 依赖于总 DNA 的宏基因组组装，其中包含宿主或摄入猎物的非微生物 DNA，样本类型、采样程序、饮食类型和消化效率等因素都会影响非微生物 DNA 的比例，进而影响下游分析。所以，测试不同非致死采样方法通过重建 MAGs 分析微生物群落的适用性至关重要。为探究样本类型在鸟枪测序微生物组分析中引入的技术偏差程度，研究人员利用 GRM 生成了与牧豆树蜥蜴（Sceloporus grammicus）相关的细菌基因组目录，并分析了粪便样本和泄殖腔拭子中微生物群的多样性、组成和功能特征。
研究方法
- 样本数据收集：研究获得墨西哥 “Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT)” 批准，在拉马林切国家公园（La Malinche National Park）进行野外工作。仅选取成年雄性牧豆树蜥蜴（吻肛长度大于 44.1mm），以避免性别对微生物群落的影响。从 10 只蜥蜴身上各采集 1 份粪便样本和 1 份泄殖腔样本，共 10 份粪便样本和 10 份泄殖腔样本。蜥蜴捕获后用布袋运至拉马林切科学站，单独饲养在塑料盒中，次日让其自然排便，用无菌镊子收集粪便样本并转移至无菌 1.5mL 管中；用酒精清洁泄殖腔外部后，使用无菌人造丝拭子插入泄殖腔开口轻轻旋转，获取泄殖腔样本并转移至无菌 1.5mL 管中。样本采集后在 4°C 冷藏运输至实验室，并在 - 20°C 保存直至 DNA 提取。
- DNA 提取和鸟枪宏基因组测序：粪便样本先用 0.15M 十水焦磷酸四钠洗涤两次，再用 0.15M 磷酸盐缓冲液（pH 8）洗涤两次，通过热 / 机械破碎进行细胞裂解；泄殖腔拭子的 DNA 提取同样采用热 / 机械破碎细胞裂解，然后用冷异丙醇和糖原沉淀。提取的 DNA 在伊利诺伊大学罗伊?J?卡弗生物技术中心进行测序。构建鸟枪基因组文库，对文库进行质量检测和定量后，在 Illumina NovaSeq 6000 SP 平台上进行 2×150 nt 双端测序，最后生成 fastq 读取文件并进行解复用。
- 生物信息学分析：原始宏基因组读取数据按照 3D’omics 欧盟地平线 2020 项目开发的生物信息学流程处理，利用 Fastp 去除接头、低质量和短读取，用 SingleM microbial fraction 估计原核生物测序比例，通过 Bowtie2 和 Samtools 比对参考宿主基因组（牧豆树蜥蜴近缘物种 S. undulatus 的基因组）去除宿主衍生读取。未映射的读取数据分别进行单独组装和共同组装，用 CONCOCT、MetaBAT2 和 MaxBin2 进行分箱，MAGScoT 进行抛光，CheckM2 评估质量，dRep 在 95% 平均核苷酸同一性（ANI）下进行去重获得细菌物种代表。去重后的 MAGs 用 GTDB-Tk 进行分类注释，利用 APE 包生成系统发育树，DRAM 进行功能预测，distillR 将功能注释提炼为基因组推断功能特征（GIFTs）。
- 统计分析：使用 R 软件进行统计分析，用 Hill 数计算细菌群落的中性、系统发育和功能多样性，通过线性混合模型量化采样方法间细菌 α 多样性差异；计算中性、系统发育和功能 β 多样性的 S?rensen 型周转率评估样本间差异，进行非度量多维缩放（NMDS）排序图可视化，用 betadisper 函数检验采样方法内的离散度差异，PERMANOVA 检验采样方法间细菌组成差异。使用 ANCOM-BC2 包进行差异丰度分析，计算 GIFTs 的群落加权值并通过线性混合模型比较样本类型间差异，p 值用 Bonferroni 方法调整。
研究结果
- 微生物基因组目录和 DNA 分数统计：从 10 份粪便样本和 10 份泄殖腔样本中获得 387,468,658 条原始测序读取，平均每个样本深度为 19,373,433 ± 6,509,982 条读取。泄殖腔拭子中宿主 DNA 比例显著高于粪便样本（泄殖腔：68.8 ± 2.5%；粪便：4.8 ± 5.6%；LMM：p=0.001）。宏基因组组装和分箱共获得 127 个 MAGs，平均完整性为 88.3 ± 11.3%，污染率为 3.4 ± 3.6%。粪便样本贡献了 97.0% 的 MAGs，泄殖腔拭子仅贡献 3.0%。质量过滤后的读取映射到 MAG 目录的比例，泄殖腔为 1.5 ± 0.9%，粪便为 57.3 ± 8.5%，经调整后的映射率在泄殖腔和粪便样本中分别为 83.5 ± 10.9% 和 77.3 ± 12.5%。
- 微生物群落的分类组成：MAGs 被分类到 10 个细菌门，主要包括变形菌门（Pseudomonadota，40.43 ± 46.45%）、芽孢杆菌门_A（Bacillota_A，23.55 ± 24.46%）、拟杆菌门（Bacteroidota，21.75 ± 23.60%）和弯曲杆菌门（Campylobacterota，9.94 ± 30.49%）。在科水平上，肠杆菌科（Enterobacteriaceae，40.37 ± 46.50%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae，21.33 ± 22.54%）等较为丰富；在属水平上，哈夫尼亚菌属（Hafnia，29.32 ± 43.63%）、沙门氏菌属（Salmonella，10.43 ± 30.69%）等占比较大。不同采样方法下，这些分类群的代表性差异显著，泄殖腔拭子中弯曲杆菌门、变形菌门和蓝细菌门的比例较高，哈夫尼亚菌属和沙门氏菌属更为丰富；粪便样本中脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、拟杆菌门、芽孢杆菌门_A 等的存在显著增加，拟杆菌属（Bacteroides）、副拟杆菌属（Parabacteroides）和菲考伊考拉菌属（Phocaeicola）突出。
- 微生物群落的多样性：四种 α 多样性指标均显示粪便样本的多样性显著高于泄殖腔拭子（LMM：p=0.001）。基于不同多样性指标的 β 多样性也有很大差异，能够明显区分两种样本类型（PERMANOVAs：p<0.001），且泄殖腔细菌组成的变化比粪便细菌组成更大（Beta Dispersion p<0.05）。对 GIFTs 的深入分析表明，两种采样方法获得的功能微生物组特征不同，20 个分析的功能特征中有 10 个在泄殖腔和粪便样本间存在显著差异。
研究结论与讨论
研究表明，在利用 GRM 表征蜥蜴肠道微生物群落时，粪便样本在恢复 MAGs 和分析细菌群落方面明显优于泄殖腔拭子。这一结论与之前一些基于 16S rRNA 测序的研究结果相符，进一步证实了粪便样本作为蜥蜴肠道微生物群落研究代理样本的优越性。
从微生物群落多样性来看，粪便样本的多样性远高于泄殖腔拭子。这可能是因为泄殖腔拭子中宿主 DNA 比例高，原核生物 DNA 比例低，严重限制了细菌基因组的重建。同时，泄殖腔微生物可能受到宿主上皮细胞脱落、抗菌黏液分泌等因素影响，导致微生物多样性降低。而粪便样本能更好地反映典型肠道微生物群落，其中的厌氧发酵细菌，如芽孢杆菌门和拟杆菌门的细菌，在粪便样本中更为丰富，这与粪便样本较高的多糖和糖降解能力相关。
在功能特性方面，虽然泄殖腔拭子中某些代谢功能的平均能力较高，如合成有机阴离子和维生素的能力，但粪便样本在多个代谢功能上表现出优势，如更高的多糖和糖降解能力、更强的降解氮化合物能力以及更高的抗生素生产能力。这些功能差异反映了肠道微生物在营养代谢、废物处理和竞争资源等方面的不同作用，进一步表明粪便样本的微生物组功能更接近典型肠道细菌群落。
此外，研究还发现，除了一个泄殖腔样本可能因残留粪便物质而具有较高多样性外，其他泄殖腔样本大多由单一细菌主导，这说明生物因素而非技术限制是导致粪便和泄殖腔样本微生物群落差异的主要原因。
该研究不仅证实了以往 16S rRNA 测序研究的部分发现，还通过 GRM 为蜥蜴相关细菌的功能能力提供了新的直接见解。随着鸟枪测序方法在肠道微生物组分析中的应用越来越广泛，研究人员应在不同动物分类群中进行类似的方法学分析，以获得更可靠的数据，从而更好地理解动物与微生物在生态和进化过程中的双向相互作用。对于牧豆树蜥蜴广泛的地理分布以及其多样的行为和生理特征，研究人员推测在其他刺蜥属物种中可能也存在类似的样本类型差异模式，但这还需要进一步研究来验证。总之，这项研究为动物微生物群落研究提供了重要参考，有助于推动该领域的深入发展。
