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为探究 MEK/ERK 信号通路在维持多能性中的作用机制，南开大学生命科学学院等研究人员开展了小鼠胚胎干细胞（ESCs）相关研究。通过定量磷酸化蛋白质组学分析等，发现 ERK 磷酸化 ESRRB 影响 ESCs 自我更新和 XEN 分化，该研究有助于深入理解 ESCs 的调控机制。
在生命科学领域，胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）宛如一颗神秘的种子，蕴含着无限的可能。它源自囊胚的内细胞团，拥有在体外无限自我更新的能力，还能分化成人体所有类型的细胞，这使其成为再生医学中极具潜力的供体细胞来源。然而，ESCs 多能性维持的分子机制却如同迷雾，亟待揭开。
MEK/ERK（丝裂原活化蛋白激酶 / 细胞外信号调节激酶）信号通路在 ESCs 的自我更新和分化过程中扮演着关键角色。以往研究发现，激活 MEK/ERK 信号会促进 ESCs 分化，而抑制该信号则有助于维持多能性。但矛盾的是，ERK 缺失会导致 ESCs 中多能性基因表达受损、增殖速率降低、细胞周期停滞、凋亡增加、端粒快速缩短以及基因组不稳定等问题，而且长期抑制 MEK 会损害小鼠 ESCs 的发育潜力。这表明 MEK/ERK 信号在调控 ESCs 多能性方面似乎有着双重作用，可其中的详细机制却并不明晰。
为了驱散这团迷雾，南开大学生命科学学院等研究机构的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了一系列研究，旨在深入剖析 ERK 在 ESCs 自我更新和分化中的作用及机制。研究成果发表在《Stem Cell Reports》上，为该领域的发展带来了新的曙光。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，运用定量磷酸化蛋白质组学分析，他们能够识别出在 ERK 基因敲除（KO）后磷酸化水平发生变化的蛋白质，从而筛选出 ERK 的底物。此外，通过体外激酶实验，验证了 ERK 对特定蛋白质的磷酸化作用；利用染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR），研究蛋白质与基因位点的结合情况；借助 RNA 分离和逆转录 - 定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析，检测基因表达水平。这些技术为研究提供了有力的支撑。
研究结果如下：
- ERK 底物的鉴定：通过定量磷酸化蛋白质组学分析，研究人员发现 ERK KO 使 169 种蛋白质中的 236 个磷酸化位点磷酸化水平降低，47 种蛋白质中的 57 个磷酸化位点磷酸化水平升高超过 1.3 倍。基因本体（GO）富集分析显示，这些 ERK 底物候选蛋白在干细胞群体维持、细胞形态发生、胚胎发育和有丝分裂细胞周期相关蛋白中显著富集。
- ERK 对 ESRRB 的磷酸化作用：在众多 ERK 底物候选蛋白中，研究人员聚焦于 ESRRB（雌激素相关受体 β），它在 ESCs 多能性调控以及胚胎外内胚层（XEN）分化中都具有重要作用。体外激酶实验证实，ERK2 能够在体外磷酸化 ESRRB。进一步研究发现，ERK2 磷酸化 ESRRB 的位点位于丝氨酸（Ser）42 和 43。
- ESRRB 磷酸化对其功能的影响：为了探究 ESRRB Ser42 和 Ser43 磷酸化的生物学功能，研究人员将这两个位点分别突变为丙氨酸（模拟未磷酸化状态，SA）和天冬氨酸（模拟磷酸化状态，SD）。荧光素酶报告基因实验表明，SA ESRRB 激活 Tbx3 启动子的能力最强，这意味着 ESRRB Ser42 和 Ser43 的磷酸化会降低其激活 Tbx3 转录的活性。
- ESRRB 磷酸化对 ESCs 自我更新的影响：研究人员构建了稳定表达 FLAG 标记的野生型（WT）、SA 和 SD ESRRB 的 E14 ESCs 细胞系。在无白血病抑制因子（LIF）的条件下进行集落形成实验，结果显示 SA OE ESCs 形成的碱性磷酸酶（AP）阳性集落更多，且未分化集落的比例更高，同时表达更多的多能性标记蛋白 OCT4。这表明 SA ESRRB 在维持 ESCs 自我更新方面更具优势，即 ESRRB 的去磷酸化有助于促进 ESCs 的自我更新。
- ESRRB 磷酸化对 XEN 分化的影响：研究人员构建了 Esrrb 基因敲除且稳定表达 WT、SA 和 SD ESRRB 的 ESCs 细胞系，并诱导其向 XEN 细胞分化。结果发现，SD ESRRB 促进 ESC 向 XEN 谱系分化的能力最强，SA ESRRB 最弱。在 XEN 细胞中，XEN 标记基因 Gata6 和 Sox17 在 SA 拯救细胞中的表达水平低于 WT 和 SD 拯救细胞。ChIP 实验表明，SA ESRRB 在 Gata6 和 Sox17 基因位点的富集程度低于 WT 和 SD ESRRB。这说明 ESRRB Ser42 和 Ser43 的磷酸化能够促进 ESCs 向 XEN 细胞分化。
- MEK/ERK 通过磷酸化 ESRRB 促进 XEN 分化：研究人员使用 MEK 抑制剂 PD0325901（PD）处理 ESCs，发现 PD 抑制了 ESCs 向 XEN 细胞的分化。进一步研究发现，SA 和 SD 拯救的 ESCs 对 PD 的敏感性低于 WT 拯救的 ESCs 和 E14 ESCs。这表明 MEK/ERK 至少部分通过磷酸化 ESRRB 促进 ESCs 向 XEN 细胞分化。
研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 ERK 磷酸化 ESRRB 在调控 ESCs 自我更新和 XEN 分化中的重要功能。ERK 对 ESRRB 的磷酸化改变了其与多能性基因和 XEN 基因的结合能力，进而影响 ESCs 的命运。然而，MEK/ERK 信号通路在促进 ESCs 多能性维持方面的机制仍有待进一步探索，且除了 ESRRB，MEK/ERK 可能还通过其他蛋白促进 XEN 分化，ESRRB 上可能存在其他 ERK 磷酸化位点。这些发现拓展了人们对 MEK/ERK 信号通路在多能性维持和 ESCs 分化中作用及机制的理解，为后续深入研究 ESCs 的调控机制奠定了坚实基础，有望推动再生医学领域的发展，为相关疾病的治疗提供新的思路和方向。
