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为解决重组腺相关病毒（rAAV）用于视网膜基因治疗时存在的转导效率低、免疫原性高及视网膜下注射有创等问题，研究人员开展了将细胞穿透肽（CPPs）展示在 AAV2 衣壳上的研究。结果发现 AAV2.CPP1 可增强视网膜细胞转导且免疫反应降低，这为视网膜基因治疗带来新希望。
在眼科医学领域，视网膜疾病一直是困扰众多患者的难题。其中，遗传性视网膜疾病（IRDs）主要由各种基因突变导致视网膜外层的光感受器和视网膜色素上皮（RPE）细胞发生退化，严重影响患者的视觉功能。目前，重组腺相关病毒（rAAV）是视网膜基因治疗的主要载体，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的 Luxturna 用于治疗莱伯先天性黑蒙，证实了其安全性。然而，现有的治疗方式仍存在诸多挑战。一方面，rAAV 转导效率较低，无法有效作用于目标细胞；另一方面，载体引发的免疫反应也不容忽视。此外，视网膜下注射虽能将 rAAV 递送至目标细胞，但这种方式具有侵入性，且只能转导有限数量的光感受器和 RPE 细胞，限制了整体治疗效果。为了突破这些困境，来自美国马萨诸塞大学医学院（University of Massachusetts Medical School）等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究，相关成果发表在《Molecular Therapy Methods》杂志上。
研究人员采用的主要技术方法包括：构建包含多种 CPPs 的 AAV2 衣壳变体文库，通过体内筛选的方式在小鼠中进行两轮筛选；制备多种携带不同荧光蛋白基因的单链（ss）和自互补（sc）rAAV 载体，用于评估转导效率；利用免疫组织化学、定量 PCR 等技术分析免疫反应、基因表达水平；建立基于基质胶 - 硫酸乙酰肝素（HS）的 Transwell 模型，评估 AAV 与 HS 的结合亲和力等。
下面来看具体的研究结果：
- AAV2 衣壳文库的开发与体内评估：研究人员从 CPPsite2.0 数据库筛选出独特氨基酸序列的 CPPs，构建了包含 1,090 个 CPPs 的文库。通过吉布森组装法将 CPPs 序列插入 AAV2 衣壳基因的特定位置，构建了多样的衣壳文库。在小鼠体内进行两轮筛选后，鉴定出 AAV2.CPP1 变体，其在视网膜中的富集度符合筛选标准。
- 单链 AAV2.CPP1 增强小鼠光感受器转导：研究人员包装了携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的单链 rAAV，包括 ssAAV2.CB6.GFP、ssAAV2.7m8.CB6.GFP 和 ssAAV2.CPP1.CB6.GFP。通过眼内注射到小鼠眼中，发现 ssAAV2.CPP1.CB6.GFP 在视网膜中呈现出更强、更均匀的 GFP 表达，在 RNA 水平上 GFP 表达显著提高，且转导的光感受器数量约为 ssAAV2.7m8.CB6.GFP 的 2.5 倍。同时，研究人员还开发了编码核定位 H2BGFP 的 AAV 基因组，进一步证实了 AAV2.CPP1 对光感受器转导的增强作用。
- 自互补 AAV2.CPP1 增强小鼠光感受器转导：对于自互补 rAAV，如 scAAV2.CB6.GFP、scAAV2.7m8.CB6.GFP 和 scAAV2.CPP1.CB6.GFP，眼内注射后发现 scAAV2.CPP1.CB6.GFP 在眼底成像中 GFP 表达更高，RNA 水平上 GFP 表达也有显著提升，转导的光感受器数量是 scAAV2.7m8.CB6.GFP 的两倍。
- AAV2.CPP1 载体降低免疫反应：通过免疫组织化学检测微胶质细胞标记物 IBA1，以及利用液滴数字 PCR（ddPCR）检测促炎细胞因子，发现与 ssAAV2.7m8.CB6.GFP 相比，ssAAV2.CPP1.CB6.GFP 诱导的免疫反应更低，视网膜中 IBA1 阳性微胶质细胞数量和 IL - 6 表达水平均较低。
- AAV2.CPP1 降低 HS 结合亲和力：Dot blot 分析表明 AAV2.CPP1 与 HS 的结合显著减少。基于基质胶 - HS 的 Transwell 模型实验显示，AAV2.CPP1 能够穿透模拟的内界膜（ILM）并转导细胞，这表明其可能通过减少 HS 结合，促进载体穿过 ILM，从而增强视网膜细胞转导。同时，分子模型显示 AAV2.CPP1 的 KLGVM 肽插入破坏了 VR - VIII 区域，影响了 HS 结合基序。
综合上述研究，研究人员成功鉴定出 AAV2.CPP1，它在通过眼内注射进行视网膜基因治疗时，展现出增强的全视网膜转导能力和较低的免疫反应。AAV2.CPP1 降低 HS 结合亲和力的特性，为其跨越 ILM 并有效转导视网膜细胞提供了可能。然而，目前该研究仅在小鼠模型中进行，在非人灵长类动物等更大动物模型中的效果尚未得到验证，且长期免疫反应、AAV 基因组同质性以及 KLGVM 在 AAV 衣壳中的细胞穿透机制等问题仍有待进一步研究。尽管如此，这项研究为视网膜基因治疗开辟了新的方向，AAV2.CPP1 有望成为一种更高效、更安全的基因治疗载体，为广大视网膜疾病患者带来新的希望。
