塔罗科血橙芽变品种果实花青素生物合成关键基因的鉴定及其调控机制研究

本研究针对中国温州发现的塔罗科血橙(Citrus sinensis cv. Tarocco)芽变品种Ouya(MT)花青素合成受抑制的现象，通过多组学联合分析揭示了DNA甲基化调控花青素合成的分子机制。研究人员比较了野生型(WT)与MT在9个发育阶段的理化特性，结合转录组和代谢组数据筛选出64个差异表达基因(DEGs)，包括CsRuby等5个转录因子和5个甲基化相关基因。实验证实5-氮杂胞苷(5-aza)处理可诱导MT果肉花青素积累，全基因组甲基化测序(WGBS)显示关键基因启动子区发生去甲基化。该研究为柑橘品质改良提供了新靶点，并为MT作为低花青素高糖酸比新品种推广提供理论支撑。

　　

在柑橘家族中，血橙因其独特的红色果肉而备受青睐，这种诱人的色泽源自花青素(anthocyanin)的积累。作为柑橘类唯一富含花青素的商业化品种，塔罗科血橙不仅具有观赏价值，其花青素成分更被证实具有增强视力、预防心血管疾病等健康功效。然而在中国温州发现的塔罗科芽变品种Ouya(MT)却表现出反常现象——成熟果实始终保持着橙黄色外观，即使经过低温储存也无法像野生型(WT)那样呈现紫红色。这个自然突变体引起了浙江大学研究人员的高度关注，因为其不仅改变了花色苷积累模式，还表现出更优的糖酸比和更大的果实尺寸，这些特征对柑橘产业具有重要商业价值。

为解析MT花青素合成受抑制的机制，研究团队采用了多组学整合分析策略。通过UPLC技术测定9个发育阶段果实的代谢物动态变化，结合Illumina Hiseq 4000平台转录组测序，筛选出关键差异基因。利用WGCNA构建共表达网络，并通过5-氮杂胞苷(5-azacytidine)处理验证DNA甲基化的调控作用，最后采用全基因组甲基化测序(WGBS)定位关键基因的甲基化位点。

材料与方法

研究选取温州凤威果园栽培的WT和MT果实，从开花后160天(DAF)开始每隔15天采样直至280 DAF。使用Minolta色差仪测定果皮和果肉颜色参数，通过UPLC定量38种花青素和6种黄酮含量。RNA-seq分析选取235、265和280 DAF三个关键时期的果肉样本，WGCNA分析整合了13个性状指标（包括花青素组分、可溶性糖和有机酸）。5-aza处理实验采用20 mM浓度注射果实，7天后进行WGBS和转录组验证。

果实表型与理化特性

表型分析显示，WT果实在220 DAF后开始积累花青素，280 DAF时果肉呈现典型的丝状红色（图1A），而MT始终维持橙黄色。定量检测证实MT果肉花青素含量仅为WT的50%，其中氰定类(cyanidin)衍生物如氰定-3-O-(6-O-丙二酰-β-d-葡萄糖苷)差异最显著（表1）。值得注意的是，MT在190 DAF时可溶性固形物(TSS)已达15°Brix，显著高于WT，且糖酸比持续高于野生型（表S4），这种早熟特性使其商业采收期比传统品种提前1个月。

转录组调控网络

WGCNA分析将9571个基因划分为7个模块，其中蓝色模块与总花青素含量呈显著正相关（图4A）。该模块富集到类黄酮生物合成等通路（图4B），并包含5个核心转录因子：CsATHB40（同源异型盒蛋白）、CsBBX18（B-box锌指蛋白）、CsLBD1（侧生器官边界域蛋白）、CsUNE10（胚胎发育调控因子）和CsRuby（MYB类转录因子）。共表达网络显示（图4D），CsRuby能正向调控花青素合成途径的结构基因（CsCHS、CsDFR等），而该基因在MT中的表达量仅为WT的1/3。

DNA甲基化调控

5-aza处理实验证实表观遗传修饰的关键作用：处理组果肉出现明显红色斑块（图5A），花青素含量提升2倍（图5B）。WGBS分析显示，5-aza导致CsCHI、CsPAL等基因启动子区CG/CHG上下文甲基化水平降低（图5H），这些基因的表达量相应上调2-5倍（图5E）。特别值得注意的是，虽然CsRuby编码区序列在WT与MT间完全一致，但其内含子区检测到4个差异甲基化位点（图S12），提示甲基化可能通过影响该转录因子的剪接效率间接调控花青素合成。

这项研究首次揭示了DNA甲基化在柑橘芽变品种花色苷合成中的调控作用，阐明了CsRuby表达受抑制的表观遗传机制。从应用角度看，MT作为天然低花青素品种，其高糖低酸的特性更符合亚洲消费者偏好，研究结果为该品种的推广提供了分子层面的理论依据。在学术层面，发现BBX18、UNE10等新型转录因子与花青素合成的关联，为柑橘品质改良提供了新的遗传操作靶点。论文中建立的"转录因子-结构基因-表观修饰"三级调控模型（图6），不仅适用于解释柑橘芽变现象，也为其他果树品质性状的遗传改良提供了参考范式。

未来研究可进一步解析CsRuby差异甲基化区域的功能，探索通过CRISPR-dCas9-TET1等表观编辑技术精准调控柑橘花青素合成的可能性。该成果发表于《BMC Plant Biology》，为柑橘功能基因组研究和分子设计育种提供了重要案例。