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为探究 2015 年台湾 DENV2 爆发原因，研究人员开展 NS1 氨基酸替换对病毒影响的研究，发现 NS1-K272R 突变影响免疫逃逸和促炎细胞因子分泌。该研究为防控登革热提供关键依据，强烈推荐科研读者阅读。
在热带和亚热带地区，登革热病毒（DENV）如同一个隐藏在暗处的 “小恶魔”，每年都悄无声息地影响着数百万人的健康。它主要通过伊蚊传播，就像伊蚊是它的 “帮凶”，带着它四处作恶。感染登革热病毒后，有的人可能只是出现轻微症状，像得了一场小感冒，过几天就好了；但对于一些特殊人群，比如年幼的婴儿、老年人，还有本身就患有其他疾病的患者来说，情况就没那么乐观了，它可能引发登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）这些严重威胁生命的疾病。
目前，登革热的爆发和反复出现，已经成为全球公共卫生的一大负担。然而，令人头疼的是，面对这个 “小恶魔”，人类还没有找到一种特效的抗病毒药物来对付它。这就好比在一场战斗中，我们知道敌人在哪里，却没有合适的武器去反击，只能眼睁睁看着它肆虐。
登革热病毒是一种单链 RNA 病毒，它的基因组会编码成一个多聚蛋白，然后再切割成各种不同的蛋白，其中非结构蛋白 1（NS1）特别值得关注。NS1 是一种糖蛋白，它能从被感染的细胞中分泌出来，在登革热患者的血液里 “游荡”。而且，血液中 NS1 水平的升高与登革出血热密切相关，所以它还能作为一个诊断标记物，帮助医生判断患者病情的严重程度。
NS1 不仅能作为诊断标记物，它在病毒的复制、免疫逃逸和免疫发病机制中都起着关键作用。它就像病毒的 “秘密武器”，一方面，它可以定位在囊泡包裹位点，帮助形成囊泡包裹，为病毒的复制 “搭建舞台”；另一方面，它还能激活一些细胞，产生促炎细胞因子和趋化因子，这些物质就像一群捣乱分子，会破坏细胞间的连接，引发炎症反应。不仅如此，NS1 还能参与免疫逃逸，它会阻断一些补体，让免疫系统难以识别和攻击病毒。
RNA 病毒有个特点，就是突变率很高，就像一群调皮的孩子，总是在不断变化。之前的研究发现，NS1 区域的一些氨基酸替换，会影响病毒的特性和疾病的严重程度。比如 1997 年古巴登革热病毒 2 型（DENV2）爆发，就和 NS1 区域的 T164S 氨基酸替换有关；还有 DENV2 16681 株中的 NS1 - G53D 替换，也会影响病毒在蚊子和哺乳动物细胞中的感染和传播。
在 2015 年，我国台湾地区爆发了严重的登革热疫情，超过 40000 人感染，其中 228 人不幸死亡。这就像一场突如其来的灾难，给当地人们的健康和生活带来了巨大的冲击。为了弄清楚这场疫情爆发的原因，找出那些可能决定 2015 年台湾地区疫情毒株毒力的关键基因变异，来自 [第一作者单位] 的研究人员在《Journal of Biomedical Science》期刊上发表了题为 “NS1 amino acid substitution K272R of dengue virus 2 contributes to immune evasion and enhanced pro - inflammatory cytokine production” 的论文。研究发现，DENV NS1 的 K272R 氨基酸替换增强了病毒的免疫逃逸能力，还促进了促炎细胞因子的产生，这很可能是导致 2015 年台湾地区登革热大规模爆发的重要原因之一。这一研究成果就像在黑暗中点亮了一盏灯，为我们了解登革热病毒的传播和致病机制提供了重要线索，也为未来防控登革热疫情提供了新的方向。
研究人员为了开展这项研究，用到了几种主要的技术方法。首先是系统发育分析，他们通过收集大量的病毒序列，构建系统发育树，来研究病毒的进化关系，就像给病毒家族绘制了一份 “族谱”。其次是基因变异分析，对比不同时期的病毒序列，找出氨基酸的替换位点。另外，还使用了反向遗传学技术，构建含有特定氨基酸替换的病毒，研究它们的特性。同时，利用定量实时 PCR 分析、ELISA 等实验技术，检测相关基因的表达和细胞因子的水平。
下面我们来看看研究人员具体都发现了什么。
- 鉴定台湾 2015 年 DENV2 疫情中的氨基酸替换：研究人员收集了 1995 年到 2014 年台湾地区 DENV2 在 GenBank 上的序列，并与 2015 年疫情中的 22 株临床分离株序列进行对比。这一对比可不得了，他们发现了总共 11 个氨基酸替换，分布在衣壳蛋白、NS1、NS2A、NS3 和 NS5 等蛋白上。特别值得一提的是，通过系统发育分析发现，2015 年台湾地区疫情毒株的 NS1 序列和全球 DENV2 Cosmopolitan 基因型参考毒株非常相似，而且还形成了一个新的分支，这说明在病毒的进化过程中发生了一些重要的变化。进一步收集亚洲国家的 DENV2 毒株序列分析后发现，和 2015 年台湾地区疫情毒株属于同一分支的其他亚洲国家毒株，在 NS1 区域只有 R272 这个氨基酸是相同的，这似乎暗示着这个氨基酸在病毒的进化和传播中有着特殊的意义。
- K272R 突变病毒在 I 型干扰素产生细胞中比野生型病毒复制更快：由于 NS1 在病毒复制中很重要，研究人员利用定点突变技术，构建了含有 NS1 区域不同氨基酸替换的 DENV2 - EGFP 反向遗传（rg）病毒。他们用这些病毒感染不同的细胞系，通过 ELISpot 检测病毒滴度，来研究病毒的生长动力学。结果发现，在 A549 细胞中，NS1 - K272R 突变病毒复制速度比野生型病毒和其他突变病毒都快，就像一个短跑健将，在细胞这个 “跑道” 上一路领先。但是在 Vero 细胞（一种 I 型干扰素缺陷细胞系）中，它们的生长动力学却没有明显差异。这表明 I 型干扰素在抑制病毒生长方面可能起着一定的作用。为了排除 I 型干扰素的影响，研究人员又在 Vero 细胞中进行了病毒竞争实验，结果发现除了 D278E 突变病毒外，其他突变病毒都比野生型病毒更有竞争优势，能在 “竞争” 中胜出。
- K272R 突变促进可溶性 NS1（sNS1）的更高分泌：之前有研究表明 NS1 的替换会影响 sNS1 的分泌，研究人员也想看看在这次的研究中是不是也是这样。他们用 rgDV2 - NS1 - K272R 和 rgDV2 - NS1 - WT 感染 A549 细胞，然后检测培养上清中 sNS1 的表达水平。结果发现，在不同时间点，rgDV2 - NS1 - K272R 感染的细胞分泌的 NS1 浓度都比 rgDV2 - NS1 - WT 感染的细胞高。而且，在 293T 细胞中转染过表达 NSI - K272R 和 NS1 - WT 的质粒后，同样发现转染 pTT5 - NS1 - K272R 的细胞分泌的 NS1 更多，这就像 K272R 这个 “小改变”，让细胞变成了一个生产 NS1 的 “小工厂”，产量大幅提高。
- 感染 K272R 突变病毒比野生型病毒表现出更低的 ISGs 表达：已知黄病毒的 NS 蛋白会抑制 I 型干扰素反应，研究人员想知道 K272R 突变病毒是不是也是这样。他们先检测了感染后细胞分泌的 IFN - β 水平，发现 K272R 突变病毒感染的细胞分泌的 IFN - β 比野生型病毒感染的细胞还要多，这说明它不是通过抑制 IFN - β 的产生来逃避抗病毒反应的。但是，进一步检测干扰素刺激基因（ISGs）的表达时却发现，感染 K272R 突变病毒的细胞中，ISGs 的表达明显低于野生型病毒感染的细胞，而且这种抑制作用是呈剂量依赖性的。在 THP - 1 衍生的 M1 型巨噬细胞中也观察到了类似的现象，这表明 K272R 突变可能是通过减弱 ISGs 的表达来抑制 I 型干扰素反应的。
- K272R 氨基酸替换有助于逃避 I 型干扰素抗病毒反应：为了进一步探究 K272R 突变病毒的免疫逃逸机制，研究人员用 IFN - α 处理感染了 K272R 突变病毒或野生型病毒的 A549 细胞，然后检测 ISGs 的 mRNA 水平。结果发现，K272R 突变病毒抑制 ISGs 表达的作用比野生型病毒更显著。在 293T 细胞中转染表达 NS1 - K272R 和 NS1 - WT 的质粒后，也得到了类似的结果。而且，研究人员还发现 K272R 突变病毒感染的细胞中，STAT1 蛋白的磷酸化受到抑制，同时细胞中细胞因子信号抑制因子 3（SOCS3）的 mRNA 表达更高。这一系列结果表明，NS1 - K272R 通过上调 SOCS3 的表达，抑制了 ISGs 的表达和 STAT1 蛋白的磷酸化，从而帮助病毒逃避了 I 型干扰素的抗病毒反应。
- K272R 突变病毒促进更高水平的促炎细胞因子分泌：研究人员还考虑到 K272R 突变病毒是否会引发更强的炎症反应。他们用 rgDV2 - NS1 - WT 和 rgDV2 - NS1 - K272R 感染 A549 细胞，通过 Western blot 检测 p65 的磷酸化情况，发现 K272R 突变病毒能更显著地激活 NF - κB 信号通路。同时，用 ELISA 检测促炎细胞因子 IL - 6 和 IL - 8 的浓度，发现 K272R 突变病毒感染的细胞分泌的这些促炎细胞因子比野生型病毒感染的细胞更多，而且在 mRNA 水平上也有同样的趋势。在 THP - 1 衍生的 M1 巨噬细胞中也观察到了类似的现象，这说明 K272R 突变病毒确实会促进更高水平的促炎细胞因子分泌。
综合以上研究结果，研究人员得出结论：NS1 - K272R 具有更强的抑制 ISGs 表达的能力，它通过抑制 STAT1 蛋白的磷酸化，加速了 DENV 的复制。同时，K272R 突变病毒感染比野生型病毒诱导更高水平的促炎细胞因子产生，这可能是由于 sNS1 的分泌增加导致的。这一研究为 2015 年台湾地区严重的登革热疫情提供了病毒学方面的解释，也为我们深入了解登革热病毒的传播和致病机制提供了重要依据。通过持续监测 DENV 的进化，我们可以更好地掌握全球登革热的传播动态，为预防和控制登革热疫情提供有力支持。此外，研究 NS1 区域在登革热疫情毒株中的分子机制，也为开发以 NS1 蛋白为靶点的抗病毒疗法提供了理论基础，有望在未来帮助我们更好地对抗登革热这个 “小恶魔”，保护人们的健康。
