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为解决 TBI 后 BBB 破坏机制及治疗靶点问题，金陵医院研究人员开展了关于 NETs 与 BBB 关系的研究。发现 NETs 经特定途径破坏 BBB，敲低 NINJ1 可改善状况。这为 TBI 治疗提供新靶点，推荐科研读者阅读。
在现代社会，交通事故、意外摔倒等情况时有发生，这使得创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury，TBI）成为了一个不容忽视的重大公共卫生问题。TBI 就像大脑的一场 “噩梦”，由外部机械力，比如剧烈的撞击引发，其高死亡率和高发病率让无数患者及其家庭陷入困境。
当大脑遭遇这场 “灾难” 时，一系列连锁反应就此开启。外力作用下，脑组织的加速 - 减速运动使得脑血管系统、神经元和神经胶质细胞受到剪切和撕裂，这就是初始的原发性损伤。而原发性损伤又会像推倒的多米诺骨牌一样，引发线粒体功能障碍、神经炎症、兴奋性毒性、钙超载和氧化应激等继发性细胞损伤。这些损伤会导致血脑屏障（Blood - Brain Barrier，BBB）受损，就如同大脑的 “防护墙” 出现了漏洞，有害的血液成分得以长驱直入，进一步加剧神经炎症，增加神经元细胞死亡，还会引发细胞毒性和血管源性脑水肿，最终导致颅内压升高，严重影响患者的神经功能预后。
血脑屏障由相邻脑内皮细胞（Brain Endothelial Cell，bEC）之间精致的紧密连接构成，这些连接就像坚固的 “铆钉”，由 occludin、claudin 和 zonula occludens（ZO）家族成员组成，它们在大脑和外周之间形成了一道选择性屏障，高度调节着中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）的内部环境。然而，TBI 后血脑屏障的功能失调机制尚未完全明确，这也使得目前针对 TBI 早期干预的治疗选择十分有限。
在 TBI 发生时，免疫系统也会 “拉响警报”。大量的中性粒细胞迅速涌入损伤部位，它们本是身体抵御感染和损伤的 “先锋部队”，但过多的中性粒细胞浸润却会带来麻烦，它们会加剧炎症反应，破坏神经血管单元，最终导致血脑屏障功能障碍。2004 年，科学家发现中性粒细胞能释放一种由髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组蛋白等物质在双链 DNA（dsDNA）上组装形成的细胞外网状结构，即中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，NETs）。NETs 在抵抗病原体时发挥着重要作用，但过多的 NETs 就像失控的 “小恶魔”，会加重炎症、促进血栓形成、导致血管损伤，参与多种疾病的发展，在 TBI 后，它也介导了包括内质网应激、凝血障碍、神经炎症、神经元凋亡和脑水肿等多种病理过程，进而导致神经功能恶化。虽然已知 NETs 会导致 TBI 后血脑屏障破坏，但具体的分子机制却一直是个未解之谜。
此外，细胞焦亡（Pyroptosis）这种新型的炎症性程序性细胞死亡也引起了科学家的关注。它以 gasdermin D（GSDMD）驱动的细胞膨胀、细胞膜孔隙形成以及细胞内促炎细胞因子（如 IL - 1β 和 IL - 18）的释放为特征。GSDMD 就像细胞焦亡的 “执行者”，是一种形成孔隙的蛋白质。研究发现，bECs 中 GSDMD 高度表达，当 bECs 发生细胞焦亡时，不仅会释放炎症因子，还会增加脑血管屏障的通透性，直接破坏血脑屏障的完整性。已有研究表明，NETs 的多个成分可被识别为 toll 样受体 4（TLR4）的配体，在脓毒症研究中发现 NETs 可通过激活 TLR4 / 核因子 κB（NF - κB）途径导致内皮细胞功能障碍，但 NET 激活的 TLR4/NF - κB 途径与 bEC 细胞焦亡之间的关系仍不清楚。
还有神经损伤诱导蛋白 1（Ninjurin - 1，NINJ1），最初它被发现是外周神经损伤后雪旺细胞中上调的一种粘附分子。近期研究揭示，NINJ1 是介导裂解性细胞死亡时质膜破裂（Plasma Membrane Rupture，PMR）和炎症因子扩散的最终效应分子。高迁移率族蛋白 B1（High Mobility Group Box 1 Protein，HMGB1）作为一种损伤相关分子模式（DAMPs），广泛参与炎症反应调节，且是 NET 形成的强效激活剂。由于 HMGB1 分子较大，需通过 PMR 释放，因此研究人员推测 NINJ1 可能调节焦亡 bECs 的 PMR，从而促进 NET 生成，进一步加重 TBI 后的损伤。
为了揭开这些谜团，来自金陵医院的研究人员在《Cell Death & Disease》期刊上发表了题为 “NINJ1 - mediated plasma membrane rupture of pyroptotic endothelial cells exacerbates blood - brain barrier destruction caused by neutrophil extracellular traps in traumatic brain injury” 的论文。他们发现，TBI 后，挫伤脑组织和循环中存在过量的 NETs，NETs 可激活 TLR4/NF - κB 途径诱导 bEC 细胞焦亡，导致血脑屏障破坏。在这个过程中，焦亡的 bECs 中 NINJ1 被激活，通过质膜破裂介导 HMGB1 释放，促进 NET 形成，形成恶性循环。而敲低 NINJ1 可减少 NET 形成，减轻血脑屏障渗漏，改善 TBI 后的神经功能结局。这一研究结果为 TBI 的治疗提供了新的潜在靶点，具有重要的意义。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们通过收集人类样本和构建小鼠 TBI 模型，模拟真实的创伤情况。利用 Western blot 技术，像 “蛋白质侦探” 一样，检测各种蛋白质的表达水平；采用免疫荧光染色技术，直观地观察蛋白质的定位和表达情况；借助 Evans blue extravasation 实验，精确评估血脑屏障的完整性；运用 ELISA 技术，准确测定 HMGB1 等蛋白的浓度；还通过分离细胞和组织，获取研究所需的样本，从而全面深入地探究 TBI 后的各种病理变化。
下面我们来详细看看研究结果：
- TBI 后脑血管周围诱导产生 NETs：研究人员构建了小鼠 TBI 模型，结果显示 3 天后小鼠出现了明显的皮质组织损失，这表明模型构建成功。通过 Western blot 分析发现，TBI 后挫伤皮层中中性粒细胞特异性标记物 NE 显著升高，在损伤后 3 天达到峰值，暗示大量中性粒细胞聚集。进一步检测 NETs 的特异性标记物瓜氨酸化组蛋白 H3（citH3），发现其表达水平也在 TBI 后升高，同样在第 3 天达到高峰。于是，研究人员选择 TBI 后第 3 天作为后续实验的检测时间点。免疫荧光实验发现，TBI 后 NE 和 citH3 水平明显增加，且 citH3?中性粒细胞在同侧大脑皮层中很容易被发现，它们正忙着生成 NETs 或者已经将 NETs 释放到细胞外空间。用 CD31 标记脑血管后发现，NETs 在血管周围富集。不仅如此，对 TBI 患者的脑样本和血液样本检测发现，患者脑样本中 citH3 显著升高，血浆中 dsDNA 浓度也明显高于健康人，TBI 小鼠的血浆 dsDNA 浓度同样增加，这说明 TBI 后 NETs 在人体和小鼠中都出现了异常升高。
- NETs 破坏 TBI 后的血脑屏障完整性：已知 NETs 会导致内皮细胞功能障碍，研究人员在体外实验中用不同浓度的 NETs 处理人脑血管内皮细胞（hCMECs），结果发现，100 ng/mL 的 NETs 刺激 24 小时后，紧密连接蛋白 occludin 和 ZO - 1 的表达显著下降，浓度增加到 500 ng/mL 时下降更明显。在体内实验中，研究人员给 TBI 小鼠连续 3 天腹腔注射 PAD4 选择性抑制剂 Cl - amidine 来抑制 NETs 产生。结果显示，Cl - amidine 处理后，挫伤皮层中 citH3 水平显著降低，表明 NETs 形成减少。同时，Western blot 结果表明，TBI 后 ZO - 1 和 occludin 表达大幅下降，而 Cl - amidine 处理有效挽救了这种下降。免疫荧光染色显示，TBI 后血管中 ZO - 1 表达明显减少，Cl - amidine 处理则减轻了这种损失。Evans blue extravasation 实验发现，TBI 小鼠大脑实质中有大量 Evans blue 染料渗漏，而 Cl - amidine 处理的小鼠渗漏明显减轻，这些结果都证实了 NETs 在 TBI 后血脑屏障破坏中起着重要作用。
- NETs 通过 TLR4/NF - κB 途径促进 bEC 细胞焦亡：研究人员用 NETs 刺激 hCMECs 后发现，NF - κB 高度磷酸化，细胞焦亡相关蛋白 GSDMD 和 caspase - 1 被激活，这表明 NETs 可诱导 hCMECs 细胞焦亡。用 TLR4 特异性抑制剂 TAK - 242 处理 hCMECs 后，p - NF - κB 水平显著降低，cleaved GSDMD 和 caspase - 1 水平也下降，说明 TAK - 242 减轻了 NET 诱导的细胞焦亡，DNase I 通过直接降解 NETs 也起到了类似的效果，这证明 NETs 可通过 TLR4/NF - κB 途径诱导 hCMECs 细胞焦亡。在体内实验中，免疫荧光染色证实了 bECs 中 TLR4、caspase - 1、GSDMD 和 NLRP3 的表达。分离挫伤皮层的血管提取蛋白进行 Western blot 分析发现，TBI 后 p - NF - κB、NLRP3、GSDMD - N 和 cleaved caspase - 1 水平均增加，表明 bECs 发生了细胞焦亡，而 TAK - 242 腹腔注射可逆转这些蛋白的增加。免疫荧光染色还显示，TAK - 242 有效降低了 bECs 中 NLRP3 的表达，进一步证明了 NETs 通过 TLR4/NF - κB 途径促进 bEC 细胞焦亡。
- NINJ1 在焦亡的 bEC 中被激活：由于 NETs 可诱导 bEC 细胞焦亡，研究人员进一步探究 NINJ1 是否参与焦亡 bECs 的 PMR。在体外实验中，用 LPS + nigericin 诱导 hCMECs 细胞焦亡，免疫荧光染色发现，诱导后 NINJ1 在细胞膜上聚集，而对照组则没有，这表明 NINJ1 在 hCMECs 细胞焦亡后被激活并在细胞膜上寡聚化。为了进一步研究 NINJ1 的功能，研究人员设计了 siRNAs 敲低 NINJ1，结果显示敲低成功。检测 PMR 标记物 LDH 的释放发现，敲低 NINJ1 后，LDH 释放显著减少，细胞上清液中 HMGB1 的释放也减少。免疫荧光染色还发现，NINJ1 主要由 bECs 表达，TBI 后其表达增加，这表明 NINJ1 在 TBI 后的炎症放大过程中发挥着重要作用。
- 敲低 NINJ1 减轻 TBI 后的中性粒细胞浸润和 NET 形成：为了研究 NINJ1 在 TBI 后 bECs 中的作用，研究人员将小鼠分为假手术组、TBI + shCTRL 组和 TBI + shNINJ1 组，在 TBI 前 21 天向小鼠侧脑室注射腺相关病毒（AAV）。结果显示，AAV - TIE - shNINJ1 成功降低了 NINJ1 的表达，且敲低 NINJ1 对未受 TBI 的小鼠脑血管屏障没有影响。ELISA 检测发现，TBI + shCTRL 组小鼠血浆中 HMGB1 浓度显著高于假手术组，而 TBI + shNINJ1 组则逆转了这种增加。由于 HMGB1 可促进 NET 形成，研究人员检测了中性粒细胞和 NET 水平，发现 TBI + shNINJ1 组中中性粒细胞标记物 MPO、NE 和 NET 特异性标记物 citH3 均显著低于 TBI + shCTRL 组，免疫荧光染色也进一步证实了这一结果，表明敲低 NINJ1 可减少 HMGB1 释放，减轻 TBI 后的中性粒细胞浸润和 NET 形成。
- 敲低 NINJ1 减轻 TBI 后 NET 介导的 bEC 细胞焦亡：既然敲低 NINJ1 可减少挫伤皮层中的中性粒细胞和 NETs，研究人员接着探究其是否能通过减轻 bEC 细胞焦亡来减少血脑屏障破坏。Western blot 分析发现，与 TBI + shCTRL 组相比，TBI + shNINJ1 组中 bECs 的细胞焦亡相关蛋白 NLRP3、caspase - 1 p20、caspase - 1 p10 和 GSDMD - N 表达下调。免疫荧光染色也显示，TBI + shNINJ1 组中 bECs 的 NLRP3 表达明显降低，这表明敲低 NINJ1 可减轻 TBI 后 NET 介导的 bEC 细胞焦亡。
- 敲低 NINJ1 减少 TBI 后的血脑屏障破坏：Western blot 分析显示，敲低 NINJ1 有效挽救了 TBI 后 ZO - 1 和 occludin 表达的下降趋势。免疫荧光染色发现，TBI + shNINJ1 组中血管被 ZO - 1 覆盖的百分比增加。Evans blue extravasation 实验表明，TBI + shNINJ1 组在损伤后 3 天和 7 天，大脑实质中 Evans blue 染料渗漏程度均低于 TBI + shCTRL 组，说明敲低 NINJ1 可减少 TBI 后的血脑屏障破坏。
- 敲低 NINJ1 改善 TBI 后的神经功能结局：神经元的程序性细胞死亡会导致神经元丢失，影响 TBI 后的运动和认知功能。研究人员检测神经元凋亡发现，TBI + shCTRL 组中 caspase - 3 p19 表达上调，而 TBI + shNINJ1 组则逆转了这种上调。免疫荧光染色显示，TBI + shNINJ1 组中凋亡神经元的百分比降低，神经元数量减少的情况也得到缓解。mNSS 评分评估发现，TBI + shNINJ1 组小鼠的神经功能缺损明显改善，表明敲低 NINJ1 可改善 TBI 后的神经功能结局。
研究结论和讨论部分指出，TBI 后血脑屏障破坏是一个关键问题，会引发一系列不良后果。本研究揭示了 NETs 在 TBI 后血脑屏障破坏中的关键作用及机制，即 NETs 激活 bECs 的 TLR4/NF - κB 途径，启动 caspase - 1/GSDMD 细胞焦亡途径，增加血脑屏障通透性。随后，焦亡 bECs 通过 NINJ1 介导的 PMR 释放 HMGB1，促进中性粒细胞形成更多 NETs，形成恶性循环。敲低 NINJ1 可中断这个恶性循环，有效减轻 TBI 急性期的血脑屏障破坏，改善神经功能结局。这一研究为 TBI 的治疗提供了新的潜在药物设计靶点，即 NINJ1，有望为 TBI 患者带来新的治疗希望。然而，研究也存在一些局限性，比如 NET 相关的 bEC 功能障碍可能还有其他机制，NINJ1 除了介导 PMR 外还有其他功能，未来还需要进一步研究来验证这些发现。但总体而言，这项研究为 TBI 的治疗研究开辟了新的方向，具有重要的科学价值和临床意义。
