纳米与微秒钙电穿孔 “对决” 癌细胞：谁主沉浮？开启结直肠癌治疗新希望

为探究 μsEP 和 nsEP 在癌症治疗中的差异，研究人员开展针对结直肠癌细胞系的研究。结果显示 nsEP 在破坏癌细胞活力等方面更有效。这为癌症治疗提供新思路，推荐科研读者阅读，助力深入了解电穿孔抗癌机制。

　　

在医学的抗癌战场上，科学家们一直在寻找更有效的治疗方法，而电穿孔技术就像是一颗备受瞩目的 “潜力新星”。电穿孔（Electroporation，EP）是一种神奇的技术，它能利用电脉冲在细胞膜的磷脂双分子层上 “开” 出小孔，就像在细胞的 “城墙” 上打开了一扇扇门，让一些原本难以进入细胞的物质能够顺利通行。这一特性让它在癌症治疗领域看到了希望，比如可以帮助把治疗药物送进肿瘤细胞内部，给癌细胞来个 “精准打击”。

钙电穿孔（Calcium electroporation，CaEP）就是电穿孔技术在抗癌战场上的一位 “得力干将”。它借助电脉冲把细胞外的钙离子送进细胞内，钙离子可是细胞里的 “多面手”，参与了基因转录、细胞增殖、分化以及细胞死亡等众多重要的生命过程。当大量钙离子涌入肿瘤细胞，就会打破细胞内原本稳定的钙离子平衡状态，让癌细胞的线粒体 “不堪重负”，最终导致 ATP（细胞的 “能量货币”）耗尽，癌细胞也就走向了死亡。

虽然微秒电穿孔（μsEP）作为一种抗癌治疗方法已经有了一定的研究和应用，但是纳秒电穿孔（nsEP）的治疗潜力还没有被充分挖掘。这两种电穿孔的 “本领” 可不一样，μsEP 主要作用于细胞的外部细胞膜，而 nsEP 不仅能作用于细胞膜，还能穿透到细胞内部的细胞器，比如内质网，引起更复杂的细胞反应。而且，不同的电穿孔参数会对细胞产生怎样的影响，目前也还不明确。此外，癌症干细胞（Cancer Stem Cells，CSCs）是肿瘤中的 “顽固分子”，它们具有很强的耐药性，是导致肿瘤复发和治疗失败的重要原因。针对这些问题，研究不同电穿孔技术对癌细胞的影响，尤其是对 CSCs 的作用，就显得格外重要。

为了深入了解这些问题，研究人员在《BMC Biology》期刊上发表了题为 “Comparison of microsecond and nanosecond calcium electroporation in sensitive and drug-resistant colorectal cancer cell lines” 的论文。研究发现，nsEP 在破坏癌细胞活力、增强氧化应激以及触发免疫反应方面比 μsEP 更有效，而且 nsEP 似乎还能降低 CSCs 的活力，这为癌症治疗提供了一种很有前景的新方法。不过，研究也发现，在有钙离子存在的情况下，nsEP 会保留 CSCs 标记物 CD133 的表达，这其中的复杂机制还需要进一步研究。这些发现表明，nsCaEP 有望成为一种既能靶向癌细胞又能靶向 CSCs 的创新治疗策略，为改善结直肠癌的治疗效果带来了新的希望。

研究人员为了开展这项研究，用到了几个关键的技术方法。他们培养了多种细胞系，包括 LoVo（敏感的人结直肠腺癌细胞系）、LoVo Dx（对阿霉素耐药的人结直肠腺癌细胞系）和 Hs738st.int（正常人肠成纤维细胞系）。然后，使用特定的仪器分别诱导微秒和纳秒电脉冲进行钙电穿孔实验。通过 MTS 和 SRB 这两种细胞活力检测方法，来评估不同处理条件下细胞的生存能力。利用检测试剂盒分别测量细胞内的 ROS（活性氧物种）水平和 ATP 水平，探究细胞内的氧化应激和能量代谢情况。还运用免疫荧光染色和免疫细胞化学染色技术，来分析不同蛋白质的表达情况，从而深入了解细胞内的生物学变化。

下面来看看具体的研究结果：

1. 细胞活力结果：研究人员用 MTS 和 SRB 两种实验方法来 “考验” 细胞的活力。MTS 实验就像是给细胞的线粒体 “做体检”，看看它们的活性如何。结果发现，随着氯化钙浓度的增加，所有被测试的细胞系活力都下降了，研究人员选择了 2mM 的氯化钙浓度进行后续研究。在不同电穿孔条件下处理细胞后，72 小时时细胞活力下降明显。微秒 CaEP（1.2 kV/cm + 2mM 的 Ca2?）能让每个测试细胞系的活力下降 36 - 37%，而纳秒参数（50 kV/cm）对癌细胞系几乎是 “致命一击”，但正常细胞（Hs378st.int）还能保留 60% 以上的活力。给 nsEP 加上钙离子（50 kV/cm + 2 mM 的 Ca2?）后，LoVo Dx 细胞的存活比例甚至降到了 46%。SRB 实验结果和 MTS 实验类似，再次验证了电穿孔和钙离子处理会降低细胞活力，而且 LoVo Dx 细胞对处理条件的抵抗能力似乎更强一点。
2. ROS 和 ATP 水平：确认了 CaEP 对细胞有毒性作用后，研究人员接着检测了细胞内 ROS 的产生情况。只有 nsEP（50 kV/cm ± 2 mM Ca2?）能让所有测试细胞系的 ROS 水平升高，正常细胞系升高约 2 倍，恶性细胞系升高 5 倍，恶性细胞系的 ROS 水平比正常细胞系高出 3 倍。为了看看细胞的能量状况，研究人员还测量了 ATP 水平，发现微秒 CaEP（1.2 kV/cm + Ca2?）和 nsEP（50 kV/cm ± Ca2?）这三种处理方式都会使 ATP 水平显著下降，而且 LoVo Dx 细胞的能量减少比 LoVo 细胞更明显。这说明 nsEP 单独就能破坏线粒体，导致 ATP 水平下降和 ROS 产生增加，而微秒 EP 则需要钙离子的 “帮助”。
3. ASPH 表达：研究人员通过免疫荧光染色来观察癌细胞中一种叫天冬氨酸 -β- 羟化酶（ASPH）的蛋白质表达情况。结果发现，CaEP 会让癌细胞中的 ASPH 信号发生明显变化。在 LoVo Dx 细胞中，CaEP 能使 ASPH 信号强度大幅增加，在 LoVo 细胞中，微秒 EP 不管有没有钙离子，以及 nsCaEP（37.5 kV/cm + Ca2?）都能使 ASPH 表达升高。正常细胞系几乎不表达 ASPH，只有在最强的 CaEP 参数处理下才稍有增加。而且，研究还发现 ASPH 和线粒体关系密切，它们在细胞内常常 “形影不离”。
4. HSP27/70 表达：热休克蛋白（HSP）家族在细胞应对压力时发挥着重要作用，就像是细胞的 “保护盾”。研究人员检测了 HSP27 和 HSP70 这两种热休克蛋白的水平，发现电穿孔时加入钙离子会使这两种蛋白的荧光强度增加。比如，在 LoVo 和 LoVo Dx 细胞中，有钙离子存在时，微秒和纳秒 EP 处理 24 小时后，HSP70 信号分别增加 2 倍和 3 倍。而且，HSP27 信号强度会随着时间升高，HSP70 信号强度则会降低。这表明，那些能杀死细胞的治疗参数会触发热休克蛋白的表达，存活下来的细胞会启动保护机制。同时，HSP 的过度表达还可能刺激免疫系统，引发抗癌免疫反应。
5. CD133 表达：CD133 是 CSCs 的一个重要标记物。研究人员在实验后的 24 - 72 小时内观察 CD133 的表达情况，发现未经处理的 LoVo 和 LoVo Dx 细胞都有明显的 CD133 表达。nsEP 在没有钙离子的情况下会使 CD133 表达下降，37.5 kV/cm 这个参数的作用最明显。但加入钙离子后，CD133 的表达下降就被 “阻止” 了，而微秒 EP 则对 CD133 表达没有影响。
6. DEDD 表达：研究人员在处理细胞 72 小时后观察含有死亡效应结构域的 DNA 结合蛋白（DEDD）的情况。结果发现，DEDD 的过表达和癌细胞的活力呈负相关，也就是说 DEDD 表达越多，癌细胞活力越低。电穿孔时加入钙离子比单独电穿孔能使 DEDD 表达更高。不同类型的电穿孔还会使 DEDD 的定位发生变化，在对照组和微秒 EP 处理后，DEDD 主要在细胞质中，而 nsCaEP 处理后，DEDD 会转移到细胞核中，其中 nsCaEP（50 kV/cm + Ca2?）处理后 DEDD 表达增加最明显。

综合研究结论和讨论部分，钙电穿孔（CaEP）使用微秒和纳秒脉冲都能有效降低癌细胞的存活率，尤其是对敏感和耐药的癌细胞系。CaEP 能触发 DEDD 表达增加，而 DEDD 负责激活细胞死亡途径和调节细胞周期。不同的电穿孔协议会导致不同的细胞反应和线粒体功能变化，nsEP 能更有效地破坏线粒体并增加 ROS 的产生。CaEP 还能通过过度表达 HSPs 来刺激免疫系统，这对于抗癌免疫反应至关重要。值得注意的是，nsEP 能降低 CD133 标记物的表达，而 CD133 与肿瘤形成、自我更新能力和耐药性密切相关。不过，目前关于钙电穿孔的细胞机制以及不同电穿孔协议在临床肿瘤学中的潜力还需要进一步研究。这项研究为癌症治疗提供了新的思路和方向，让我们对钙电穿孔技术在抗癌领域的应用有了更深入的认识，有望推动未来癌症治疗方法的创新和发展。