编辑推荐：
为解决肺部疾病治疗中药物靶向递送难题，美国研究人员开展用单一组分 IAJD 递送 TGF-β mRNA 治疗小鼠下肺部疾病的研究。结果显示该方法有效且安全，为肺部疾病治疗提供新方向，值得科研人员一读。
在医学领域，急性肺损伤（ALI）就像一个可怕的 “幽灵”，每年在美国，它无情地 “袭击” 约 20 万人，导致极高的发病率和死亡率。这个 “幽灵” 的危害可不小，它会引发上皮屏障功能障碍、肺泡损伤、肺水肿和表面活性剂功能障碍，这些变化就像一场场 “小灾难”，不断破坏着肺部的正常功能。
你知道吗？我们的肺就像一棵倒立的大树，有着复杂的结构。从气管开始，像树干一样不断分支，一共会经历 23 代的分支变化。其中，0 - 16 代是传导气道，就像是大树的主要枝干，负责把空气输送到更细的地方；16 - 23 代则是呼吸气道，这部分就像是大树的细枝末节，承担着气体交换的重要任务。而 ALI 带来的很多危害，比如液体渗漏，主要发生在第 16 代以后的肺实质部分。然而，要把药物精准地送到这个关键区域，却困难重重。就好比在茂密的森林里找一个小小的目标，不仅特异性差，分布也不均匀，这就导致在治疗 ALI 时存在一个明显的 “缺口”，迫切需要找到新的方法来解决这个难题。
与此同时，mRNA 疫苗的发展在抗击新冠疫情的过程中取得了重大突破。不过，目前常用的四组分脂质纳米颗粒（LNP）在将 mRNA 靶向递送到肺部时，却遭遇了 “滑铁卢”，效果并不理想。在这样的背景下，为了攻克肺部疾病治疗的难题，来自美国相关研究机构的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了一篇名为《Targeted delivery of anti-inflammatory cytokine mRNA to the lower lung using one - component ionizable amphiphilic Janus dendrimers》的论文。他们发现，利用单一组分的可电离两亲性 Janus 树状大分子（IAJD）作为载体，能够成功地将抗炎细胞因子 mRNA 递送到小鼠的下肺部，而且这种递送是暂时的，还能降低纤维化发展的风险。这一发现就像在黑暗中找到了一盏明灯，为肺部疾病的治疗带来了新的希望，对肺部疾病的治疗有着重要的意义。
为了完成这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们通过动物实验，观察不同处理下小鼠的肺部变化；利用生物发光技术，来评估 mRNA 在小鼠体内的递送效果；采用免疫印迹技术，检测蛋白质的表达情况；运用流式细胞术，分析细胞的表型和功能变化；还借助组织学和免疫组化技术，观察肺部组织的病理变化和蛋白质的定位表达。这些技术就像研究人员手中的 “魔法工具”，帮助他们一步步揭开研究的奥秘。
下面，让我们一起来看看研究人员通过这些技术都发现了什么。
用于肺部靶向 mRNA 递送的肺特异性 IAJD34 的表征
研究人员发现，有很多 IAJD 都具有靶向肺部的能力，其中 IAJD34 表现尤为突出。它有着相对较大的化学结构，pK<sub>a</sub>值为 6.74，这使得它具有很强的肺特异性靶向能力，因此被研究人员选中进行深入研究。
研究人员给小鼠注射了用荧光素酶 mRNA（Luc mRNA）和 IAJD34 制成的制剂（Luc mRNA - IAJD34），然后通过 IVIS 成像系统观察。结果发现，注射 4 小时后，小鼠肺部的荧光素强度非常强，比其他器官高出好几个数量级，就好像肺部变成了一个 “小太阳”，在黑暗中闪闪发光。这清楚地表明，IAJD34 能够精准地把 mRNA 送到肺部。
接着，研究人员又观察了荧光素蛋白产生的动力学变化。他们给小鼠注射 Luc mRNA - IAJD34 制剂后，在不同时间点（4、24、48 和 72 小时）对小鼠进行成像。发现荧光素强度在注射后 4 小时达到峰值，之后逐渐下降。到 24 小时，虽然强度有所降低，但仍然保持在较高水平；48 和 72 小时后，下降得更加明显。这就像是一场绚烂的烟花表演，一开始光芒四射，然后逐渐黯淡。
研究人员还研究了 Luc mRNA - IAJD34 制剂的稳定性。他们把制剂在 +4°C 的环境下保存 5 天，然后注射到小鼠体内，发现其全身荧光素酶强度与新鲜制备的制剂相比，并没有明显变化。而且，IAJD34 与转化生长因子 - β（TGF - β）mRNA 制成的制剂在 +4°C 下至少能稳定保存 5 周。这说明这些制剂就像一群 “坚强的小战士”，在一定条件下能够保持稳定，随时准备 “战斗”。
研究人员还进行了剂量实验，给小鼠注射不同剂量（10、20 和 30 μg）的 Luc mRNA - IAJD34 制剂，发现肺部特异性荧光素酶表达随着剂量的增加而增加，在 30 μg 剂量时达到了 9.3×108。对 30 μg 剂量组的小鼠肺部组织进行免疫组化染色后发现，荧光素酶蛋白在肺泡上皮中分布均匀，与对照组相比，上呼吸道的染色极少。这表明 IAJD34 能够成功地把 mRNA 送到肺泡水平，为肺部疾病的治疗带来了新的可能。
治疗性 mRNA 肺部递送的评估
在确认了 IAJD34 的肺部特异性后，研究人员把目光聚焦在设计一种用于肺部靶向递送的治疗性 mRNA 上。他们选择了 TGF - β，这是一种与 ALI 的缓解密切相关的抗炎细胞因子。
研究人员首先验证了 TGF - β mRNA 的生产和质量，并且在人胚肾（HEK293）细胞中转染 TGF - β mRNA 后，成功确认了其蛋白质表达。这就像是为后续的研究打下了坚实的 “地基”。
接着，研究人员给小鼠注射不同剂量（10、20 和 30 μg）的 TGF - β mRNA - IAJD34 制剂，24 小时后测量支气管肺泡灌洗液（BAL）中的各项指标。结果发现，10 μg 和 20 μg 的剂量对 BAL 中的磷脂或总细胞计数没有影响，但是 30 μg 剂量却导致 BAL 液中的蛋白质和中性粒细胞显著增加，这意味着上皮屏障出现了功能障碍。不过，有趣的是，虽然 BAL 液中的蛋白质增加了，但 IL - 6 水平并没有明显升高，这说明这可能是大量 TGF - β 递送的下游效应，而不是 IAJD34 制剂的副作用。
研究人员还对小鼠的各个器官进行了组织学检查，发现不同剂量的 TGF - β mRNA - IAJD34 制剂对肝脏、脾脏和肾脏都没有造成明显的病理改变。在肺部组织学检查中，发现随着 TGF - β 剂量的增加，纤维蛋白沉积和淋巴细胞浸润有所增加，这是高剂量 TGF - β 预期会出现的现象。同时，通过测量血清中的肝酶（AST 和 ALT）来评估肝功能，发现 30 μg 剂量时 ALT 升高，AST 没有明显变化。综合这些结果，研究人员认为 10 μg 和 20 μg 剂量的 TGF - β mRNA - IAJD34 制剂对全身的病理和毒理学影响较小，即使是 30 μg 的最高剂量，全身毒性标志物的增加也很有限。
研究人员还通过流式细胞术评估了肺泡巨噬细胞（AM）的激活情况。他们发现，不同剂量的 TGF - β mRNA - IAJD34 制剂对 AM 的表型没有明显的剂量依赖性差异，大多数细胞在各种条件下都是驻留 AM（Ly6c?/CD11c+），这与没有观察到急性炎症激活的结果一致。对于间质巨噬细胞（IM），虽然所有剂量的 TGF - β mRNA - IAJD34 都使 Ly6c+ IMs 增加，但 CD11c+或 CD206+的表达并没有增加。总体来说，与对照组相比，TGF - β mRNA - IAJD34 治疗并没有引起 IMs 的急性炎症激活。不过，为什么 TGF - β mRNA - IAJD34 治疗会增加 IMs 中的 Ly6c，还需要进一步研究。
研究人员通过蛋白质印迹法确认了 TGF - β mRNA - IAJD34 能够到达肺部并且被加工。他们发现，所有剂量组的裂解 TGF - β 都比对照组显著增加，而未加工和总 TGF - β 仅在 20 μg 和 30 μg 组显著增加。这表明 TGF - β mRNA - IAJD34 成功地将 TGF - β 递送到肺部并进行了加工。
研究人员还评估了 BAL 液中其他细胞因子和趋化因子的水平，发现 TGF - β mRNA - IAJD34 处理后，一些细胞因子发生了变化。例如，30 μg 剂量的 TGF - β mRNA - IAJD34 使抗炎症促中性粒细胞生长因子粒细胞集落刺激因子（G - CSF）升高，而促炎细胞因子白细胞介素 - 1α（IL - 1α）、白细胞介素 - 9（IL - 9）和肿瘤坏死因子（TNFα）则呈剂量依赖性下降。这说明 TGF - β 蛋白表达改变了促炎和抗炎细胞因子的下游信号传导。
最后，研究人员研究了代谢上调情况。他们对 CD45+肺消化细胞进行了糖酵解应激试验和线粒体应激试验。结果发现，TGF - β mRNA - IAJD34 注射导致糖酵解呈剂量依赖性增加，20 μg 和 30 μg 组与对照组相比有显著增加；在最大呼吸方面，虽然 TGF - β mRNA - IAJD34 诱导了剂量依赖性增加，但并不显著。这表明 TGF - β mRNA - IAJD34 成功地改变了巨噬细胞的表型和细胞因子表达，与预期的 TGF - β 蛋白产生效果一致。
随时间评估 TGF - β mRNA - IAJD34 的肺部递送情况
由于 10 μg 剂量的 TGF - β mRNA - IAJD34 制剂表现出低毒性、对细胞表型影响有限，并且能够有效表达 TGF - β 蛋白和下游信号，研究人员选择这个剂量进行进一步研究。
研究人员给小鼠注射 10 μg 剂量的空 IAJD34 或 TGF - β mRNA - IAJD34，在 4、24 和 48 小时后进行观察。结果发现，TGF - β mRNA - IAJD34 治疗在任何时间点都没有增加 BAL 蛋白或磷脂。通过免疫组化染色发现，TGF - β 蛋白在肺组织中短暂表达，在注射后 4 小时达到峰值，并且持续到 48 小时。对全肺组织中的未加工和裂解 TGF - β 进行测量，发现所有形式的 TGF - β 在注射后 4 小时都显著增加，裂解 TGF - β 在 24 小时增加，48 小时后与对照组相比没有显著增加。同时，与对照组相比，在任何时间点 AM 或 IM 的炎症激活都没有变化，只是观察到 Ly6c+ IMs 略有增加。这说明 10 μg 剂量的 TGF - β mRNA - IAJD34 能够将大量且短暂的 TGF - β 递送到肺部，不会引起明显的炎症或毒性。短暂表达在治疗上非常有益，因为长期的 TGF - β 表达可能会导致纤维蛋白沉积和纤维化。不过，未来可能需要重复给药，直到病情得到缓解。
TGF - β mRNA - IAJD34 可减轻博来霉素（bleomycin）暴露后的肺部损伤
肺部靶向递送治疗性 mRNA 的最终目标是为肺部损伤和疾病开发治疗策略。气管内注射博来霉素（ITB）是一种常用的 ALI 实验室模型，在这个模型中，小鼠在最初的 7 天会出现急性肺部炎症，大约 14 天后会逐渐发展为纤维化，21 - 28 天后炎症逐渐消退。
研究人员用 10 μg 剂量的 TGF - β mRNA - IAJD34 或空 IAJD34 处理暴露于博来霉素或 PBS 对照的小鼠，3 天后对小鼠进行评估。他们发现，ITB 会导致小鼠体重下降，TGF - β mRNA - IAJD34 治疗对此没有影响。在肺部组织学方面，ITB 使肺泡上皮厚度增加，而 TGF - β mRNA - IAJD34 治疗能够抑制这种增加。不过，由于评估时间点较早以及使用 BALB/c 小鼠作为模型的局限性，ITB 引起的组织学改变有限。
在肺部损伤的其他指标方面，ITB 导致 BAL 液中蛋白质含量显著增加，TGF - β mRNA - IAJD34 治疗虽然降低了蛋白质水平，但没有达到显著差异。ITB 和 TGF - β mRNA - IAJD34 对 BAL 液磷脂水平都没有影响，这可能是因为 3 天的时间点较短。在细胞方面，ITB 导致 BAL 细胞减少，而 TGF - β mRNA - IAJD34 治疗能够防止这种减少。进一步分析发现，TGF - β mRNA - IAJD34 治疗虽然不能阻止 ITB 诱导的驻留 AM 减少，但能够减轻招募 AM 的增加。对于 IMs，ITB 暴露导致 Ly6c+ IMs 减少，TGF - β mRNA - IAJD34 治疗在这个时间点对 IMs 没有影响。
研究人员还评估了 TGF - β mRNA - IAJD34 对 ITB 暴露后细胞因子信号传导的下游影响。他们发现，ITB 暴露使 G - CSF、IL - 6 和 CXCL - 10 等促炎细胞因子水平升高，而 TGF - β mRNA - IAJD34 治疗能够阻止这些细胞因子的增加，这与 TGF - β 的抗炎信号传导一致。同时，ITB 暴露导致 IL - 1α 和 IL - 2 减少，TGF - β mRNA - IAJD34 治疗对此没有影响，其原因可能是驻留 AM 细胞的损失。
综合这些研究结果，研究人员发现 IAJD34 能够成功地将荧光素酶 mRNA 递送到肺部，并且特异性地靶向肺实质。这对于治疗大多数肺部损伤和相关疾病具有重要的治疗优势，因为能够精准地到达小气道，尤其是呼吸树第 16 代以后的呼吸区域，这是治疗肺部疾病的关键。虽然目前还不清楚 IAJD34 颗粒为什么能够定位于肺部，但研究人员推测这可能与它的亲脂性和带电性质有关。TGF - β mRNA - IAJD34 能够将剂量依赖性的 TGF - β mRNA 递送到肺部，并且产生的 TGF - β 蛋白能够被加工并介导下游细胞因子信号传导。TGF - β 的递送在 48 小时内是短暂表达的，这一点非常重要，因为长期递送 TGF - β 可能会导致严重的纤维化。
在治疗 ITB 诱导的肺部损伤方面，虽然在 BALB/c 小鼠模型中，3 天时间点的治疗对肺组织学和屏障功能的改善有限，但研究人员成功地将 TGF - β 递送到下肺部，并观察到了显著的信号传导效应，而且这种效应是暂时的，符合治疗的要求。为了进一步确立 TGF - β mRNA - IAJD34 在 ALI 模型中的治疗作用，研究人员未来需要研究 TGF - β 在损伤后 7 天或更长时间的作用，这可能需要多次给药方案。这项研究为治疗 ALI 和其他肺部疾病开辟了新的道路，展示了 mRNA 递送在肺部治疗中的巨大潜力，就像为肺部疾病的治疗打开了一扇新的大门，让我们看到了未来治愈这些疾病的希望。
