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为探究观察性恐惧（OF）相关神经机制，美国 UT Southwestern 的研究人员研究 MD-ACC 通路，发现其对 ACC 神经元 OF 相关活动有影响，为理解 OF 神经机制提供依据。
一、研究背景
恐惧，作为一种重要的情绪反应，对个体和群体的生存起着至关重要的作用。它就像身体的警报系统，能让我们及时察觉到周围环境中的潜在危险。在日常生活中，我们常常会发现，即使自己没有直接处于危险之中，当看到他人表现出恐惧时，也会不由自主地感到害怕。这种现象被称为观察性恐惧（Observational Fear，OF），它是一种共情反应，即一个个体在厌恶情境下表现出的恐惧，会引发另一个个体产生恐惧反应。在动物界，这种现象也十分常见，比如老鼠看到同伴处于痛苦或恐惧的状态时，即便没有直接接触到引发恐惧的刺激，也会表现出更高的恐惧和焦虑相关行为，像静止不动或蜷缩起来。
过往研究表明，前扣带回皮质（Anterior Cingulate Cortex，ACC）、基底外侧杏仁核（Basolateral Amygdala，BLA）以及 ACC 到 BLA 的投射在 OF 过程中发挥着关键作用。当个体观察到示范者遭受厌恶刺激（如电击）时，ACC 中的部分神经元会被激活。然而，ACC 中与 OF 相关的神经活动表达背后的神经回路机制却一直是个谜。同时，内侧背侧丘脑（Mediodorsal Thalamus，MD）也被证实对 OF 至关重要，并且 MD 神经元会投射到 ACC。基于此，研究人员推测 MD 到 ACC 的投射可能会促进 ACC 中与 OF 相关的活动，进而触发 OF 反应。为了验证这一假设，美国 UT Southwestern 的研究人员展开了深入研究。
二、研究方法
研究人员选用 C57BL/6J 雄性小鼠作为实验对象，严格遵循 NIH 指南和 UT Southwestern 机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准程序进行实验。
在实验装置方面，使用了特制的观察性恐惧装置。该装置是一个恐惧条件反射箱，被透明有机玻璃隔板分为两个 chambers，分别为观察者 chamber（15 cm W x 20 cm D x 20 cm H）和示范者 chamber（15 cm W x 20 cm D x 20 cm H）。示范者 chamber 的不锈钢棒状地板可对示范者施加轻微电击，而观察者 chamber 有不透明有机玻璃地板，防止观察者看到电击网格或意外遭受电击。整个装置放置在隔音的恐惧条件反射箱内，避免外界噪音干扰。
实验采用了多种关键技术。首先是立体定位手术，利用数字小动物立体定位仪和显微镜，在小鼠麻醉后进行操作。通过微注射技术，将不同的病毒载体注射到特定脑区。比如，为了可视化 ACC 输入神经元，向右侧 ACC 注射 CTB - 555；为了在 ACC 中表达钙指示剂 GCaMP6f 以及抑制 MD - ACC 通路，分别向右侧 ACC 和右侧 MD 注射 AAV<sub>2/5</sub>-Syn-GCaMP6f 和 AAV<sub>2/5</sub>-hSyn-eNpHR3.0-mCherry 。之后，在 ACC 植入 GRIN 镜头，用于后续的钙成像实验。
在实验过程中，结合体内钙成像技术，使用微型荧光显微镜（Inscopix nVoke2）在 OF 行为实验期间捕获 ACC 神经元的钙活动。同时，运用光遗传学技术，通过在特定时间照射红色 LED，实现对 MD - ACC 通路的光遗传学抑制，观察其对 ACC 神经元活动和 OF 行为的影响。
实验结束后，对钙成像数据进行详细分析。利用 Inscopix 数据处理软件（IDPS）对原始数据进行预处理、空间带通滤波和运动校正，去除噪音和外部干扰。然后通过主成分分析 - 独立成分分析（PCA - ICA）方法识别单个细胞，并使用自定义的 MATLAB 脚本进一步分析细胞的钙瞬变情况。对于行为数据，通过 VideoFreeze 视频恐惧条件反射软件记录小鼠行为，利用 BORIS 事件记录平台手动标记小鼠的运动、静止和跳跃时期，对 OF 行为进行量化分析。
三、研究结果
- MD 到 ACC 的投射：向 ACC 注射逆行示踪剂 CTB - 555 后，在 MD 中发现了 CTB 阳性细胞，这表明 MD 神经元会投射到 ACC。同时，在 anteromedial thalamus（AM）也发现了少量 CTB 阳性细胞，这与之前的研究报道一致。
- ACC 神经元在 OF 期间的活动：通过在 ACC 中表达 GCaMP6f 并植入 GRIN 镜头，对小鼠在 OF 过程中 ACC 神经元的钙活动进行体内成像。在 3 只小鼠的 5 次实验中，共检测到 391 个 GCaMP 表达细胞。研究发现，部分 ACC 神经元在示范者遭受电击时，钙活动会从基线水平增加。通过定量分析，确定了 27 个（6.9%）神经元为电击响应细胞（Shock Responding Cells，SRCs）。此外，与之前在 BLA 中观察到的情况不同，在 ACC 中未发现电击抑制细胞（Shock Suppressed Cells，SSCs）。
- MD - ACC 通路对 ACC 神经元 OF 相关活动的影响：利用在 MD 神经元中表达的 eNpHR3.0 - mCherry，在示范者遭受电击时，通过照射红色 LED 对 MD - ACC 通路进行光遗传学抑制。结果发现，27 个 SRCs 中的 26 个（96.4%）在红光照射（MD - ACC 通路抑制）期间，电击响应活动受到抑制，这些细胞的 GCaMP6f 活动也有所下降或维持在基线水平。此外，还观察到了另一群特殊的 SRCs，它们在红光关闭（MD - ACC 通路未抑制）时电击时刻活动无明显增加，但在红光开启（MD - ACC 通路抑制）时活动显著增加。
- MD - ACC 通路对 OF 行为的影响：研究人员观察了在红光关闭和开启条件下，观察者小鼠的冻结反应总时长、冻结发作次数和持续时间等指标。结果发现，在两种条件下，这些指标均未出现显著差异。
四、研究结论与讨论
本研究发现，在小鼠的 OF 过程中，ACC 中的部分神经元会表现出电击响应活动，并且 MD - ACC 通路在调节这种活动中起着关键作用。当 MD - ACC 通路被光遗传学抑制时，ACC 中 SRCs 的电击响应活动显著降低，这表明 MD - ACC 通路介导了 OF 过程中 ACC 的电击响应活动。
有趣的是，研究还发现小鼠 ACC 中 SRCs 的比例（6.9%）远低于之前在大鼠中的研究结果（61.7%），这可能与小鼠和大鼠在 OF 反应强度上的差异有关。同时，虽然光遗传学抑制 MD - ACC 通路显著抑制了 ACC 中的电击响应活动，但在本实验中未观察到对 OF 行为的明显影响。研究人员推测，这可能是由于通过 GRIN 镜头对 ACC 进行的红光照射不完全，或者是 ACC 接受来自多个丘脑亚区域的输入，在 MD - ACC 通路被抑制时，其他输入或 MD 到其他区域的投射起到了补偿作用。
此外，研究中还观察到在 MD 抑制期间，部分 ACC 神经元的活动增加，这可能暗示着 MD 和 ACC 之间存在抑制性通路。之前的研究表明，MD 和 ACC 之间存在通过抑制性中间神经元的直接抑制连接，这些抑制性神经元可能在调节 ACC 活动和 OF 行为中发挥着重要作用，但还需要进一步研究来证实这一点。
总体而言，该研究揭示了 MD - ACC 通路在小鼠 OF 相关神经活动中的重要作用，为深入理解 OF 的神经机制提供了新的视角，也为后续研究奠定了基础。该研究成果发表于《Molecular Brain》期刊。
