鲍曼不动杆菌 OmpA 通过 CaMKK2 依赖的 AMPK 通路抑制宿主自噬：揭示感染新机制与潜在治疗靶点

本文聚焦鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）。研究发现其外膜蛋白 A（OmpA）通过抑制 CaMKK2 磷酸化，阻碍宿主自噬（autophagy），经 AMPK - ULK1 通路影响细菌存活。这为理解鲍曼不动杆菌感染机制提供新视角，也为开发新疗法指明方向，值得关注。

　　### 引言
鲍曼不动杆菌是临床重要病原体，广泛分布于环境中，在医院感染中常见，尤其在呼吸道和泌尿道感染方面，给治疗带来挑战。其外膜蛋白 A（AbOmpA）与医院内肺炎、菌血症死亡率相关，是潜在治疗靶点。

自噬是细胞内降解和回收蛋白质、清除受损细胞器的过程。在自噬过程中，微管相关蛋白 1 轻链 3（LC3）和 ATG 参与调节，形成 LC3 - 磷脂酰乙醇胺共轭物（LC3 - II），促进自噬体形成。自噬起始激酶 Unc - 51 样激酶 1（ULK1）受哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和 AMP 激活蛋白激酶（AMPK）等上游调节因子磷酸化激活。

此前研究表明，鲍曼不动杆菌可通过 mTOR 信号通路或 AMPK / 细胞外信号调节激酶（ERK）/mTOR 信号通路诱导自噬，AbOmpA 和 AbOmp33 也能诱导自噬。然而，细菌与自噬的相互作用复杂，部分细菌可逃避自噬，如大肠杆菌 O157:H7 抑制宿主自噬，结核分枝杆菌等则利用自噬促进生长。对于鲍曼不动杆菌，其与自噬的相互作用机制尚不完全清楚，本研究旨在探究鲍曼不动杆菌和 AbOmpA 对细胞自噬的影响及潜在分子机制。

结果

1. 鲍曼不动杆菌诱导 RAW 264.7 细胞中 AMPK - ULK 通路磷酸化：当 AMPK 激活时，会抑制 mTORC1 和 ULK Ser⁷⁵⁷磷酸化，促进自噬，同时诱导 ULK1 在 Ser³¹⁷磷酸化，启动自噬。研究发现，AbOmpA 突变株感染的细胞中，AMPK 和 ULK Ser³¹⁷磷酸化水平高于野生型（WT）和互补菌株感染的细胞。同时，mTORC1 激活会抑制自噬，而雷帕霉素可抑制 mTOR，增加自噬。在 AbOmpA 突变株感染的细胞中，mTOR、70S6K 和 ULK1 Ser⁷⁵⁷的激活受到抑制。此外，AbOmpA 突变株感染的细胞中，Beclin - 1 和 ATG16L1 磷酸化增加，ATG12 - 5 结合水平升高，LC3 - II 水平升高，P62 表达降低，表明 AbOmpA 突变株感染的细胞自噬诱导水平更高。感染 6 小时后，AbOmpA 突变株与 GFP - LC3 的共定位明显，而 WT 和互补菌株共定位较弱，且 AbOmpA 突变株呈现双膜结构，提示 AbOmpA 参与感染早期自噬的限制。
2. AbOmpA 抑制 RAW 264.7 细胞中的自噬泡：自噬通过酸性溶酶体与自噬体融合降解入侵细菌。研究通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估自噬体与溶酶体的融合情况。结果显示，AbOmpA 突变株感染的细胞中酸性泡数量比 WT 菌株多 20%，脂质泡数量也有差异。AbOmpA 突变株中溶酶体相关膜蛋白 2（LAMP2）与 LC3B 的共定位显著增加，而 WT 和互补菌株共定位较弱。转染 GFP - LC3 - RFP - LC3ΔG 探针检测自噬通量发现，AbOmpA 突变株中 RFP - LC3 和 GFP - RFP 共定位增加，GFP/RFP 比值降低。用氯喹和巴氟霉素 A1 处理后，AbOmpA 突变株中 LC3 - II 和 p62 积累显著高于 WT 菌株，表明 AbOmpA 突变株强烈诱导自噬，且 AbOmpA 可能抑制自噬体 - 溶酶体融合。
3. 外源性 AbOmpA 阻断 AMPK 通路：研究发现外源性 AbOmpA 能有效抑制各不动杆菌菌株诱导的 AMPK 磷酸化，与 AMPK 抑制剂 BML - 275 作用相似，抑制 AMPK - ULK 通路。用氯喹和外源性 AbOmpA 处理后，AbOmpA 突变株中 LC3 和 p62 积累增加，表明外源性 AbOmpA 抑制自噬 - 溶酶体融合。在饥饿条件下，外源性 AbOmpA 显著抑制 AMPK 磷酸化，增加 mTOR 磷酸化，降低 LC3 水平，增加 p62 水平，且该抑制作用具有特异性，AbOmp33 和 EcOmpA 等无此作用，煮沸变性的 AbOmpA 也失去抑制作用。
4. 自噬在鲍曼不动杆菌感染期间受 Ca²⁺/ 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 2（CaMKK2）与 AbOmpA 相互作用抑制：AMPK 磷酸化主要由 LKB1、CaMKK2 和转化生长因子 - β 激活激酶 1（TAK - 1）诱导。研究发现，鲍曼不动杆菌感染诱导 LKB1 磷酸化，但外源性 AbOmpA 不影响其磷酸化。AbOmpA 突变株中 TAK - 1 和 CaMKK2 磷酸化高于 WT 和互补菌株，外源性 AbOmpA 抑制 TAK - 1 和 CaMKK2 磷酸化。在饥饿条件下，AbOmpA 降低 CaMKK2 磷酸化，而 LPS、EcOmpA 和 AbOmp33 无此作用。通过小干扰 RNA（siRNA）沉默camkk2发现，在 CaMKK2 沉默的细胞中，AbOmpA、AbOmp33 和 EcOmpA 不影响 LC3 - II 水平、AMPK 和 ULK Ser³¹⁷磷酸化。共免疫沉淀实验表明 AbOmpA 与 CaMKK2 在细胞质中相互作用，CRISPR - Cas9 敲除 CaMKK2 后，外源性 AbOmpA 对自噬通路的抑制作用消失，感染后细胞内细菌数量增加，且外源性 AbOmpA 对 LC3 水平和溶酶体共定位的抑制作用也消失，表明 AbOmpA 通过与 CaMKK2 相互作用抑制自噬。
5. AbOmpA 介导的自噬在肺组织鲍曼不动杆菌感染中起关键作用：此前研究表明鲍曼不动杆菌的 OmpA 与 SD 大鼠肺部 mTOR 信号通路相关，影响细菌定植和传播。本研究在 BALB/c 小鼠模型中发现，AbOmpA 突变株感染后肺部生物发光减弱，肺组织中 CaMKK2、AMPK 和 ULK Ser³¹⁷磷酸化水平升高，LC3 - II 表达增加，表明 OmpA 通过抑制肺组织自噬逃避宿主免疫防御系统。

讨论

本研究发现鲍曼不动杆菌的 OmpA 抑制 CaMKK2 磷酸化，调节下游 AMPK、mTOR 和 ULK1 的激活，导致自噬信号减弱。在饥饿条件下，AbOmpA 也抑制 AMPK 和 CaMKK2 磷酸化。

细菌可通过阻碍自噬或逃避免疫系统存活。如鼠伤寒沙门氏菌抑制 AMPK 激活、激活 mTOR 以克服巨噬细胞自噬；肠致病性大肠杆菌利用效应蛋白 EspG 抑制自噬诱导；福氏志贺菌的 OspB 激活 mTORC1 抑制自噬。此前研究报道 AbOmpA 可通过 MAPK/JNK 信号通路在 HeLa 细胞中诱导自噬，通过 mTOR 信号通路在 SD 大鼠肺部诱导自噬，但本研究发现 AbOmpA 突变株在感染早期诱导自噬能力更强，且 AbOmpA 抑制自噬体 - 溶酶体融合，表明 AbOmpA 在鲍曼不动杆菌感染过程中抑制自噬。

外膜蛋白（OMPs）与自噬、凋亡关系密切。如鲍曼不动杆菌 Omp33 - 36 蛋白诱导凋亡、阻断自噬；EcOmpA 等通过 mTORC2 依赖的自噬途径刺激 LC3B 和 p62 降解；铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌的外膜囊泡（OMVs）诱导上皮细胞自噬；单核细胞增生李斯特菌的 OMVs 抑制自噬反应。本研究表明外源性 AbOmpA 在感染和饥饿应激条件下抑制自噬，且低浓度 AbOmpA 有效抑制自噬起始阶段，高浓度时可能因诱导凋亡而影响自噬，这表明凋亡与自噬存在相互作用。

CaMKK2 对能量、葡萄糖代谢、炎症和癌症等生理过程有重要影响。本研究发现鲍曼不动杆菌感染诱导 LKB1 磷酸化，但 AbOmpA 对其无影响。AbOmpA 突变株在体内外诱导更高的 CaMKK2 磷酸化，外源性 AbOmpA 抑制 CaMKK2 磷酸化，沉默camkk2可减弱 AbOmpA 对自噬诱导的抑制作用，表明 AbOmpA 通过与 CaMKK2 相互作用抑制自噬。

本研究为 AbOmpA 的功能提供新视角，但未深入探讨凋亡、自噬和其他调节细胞死亡机制的联系。未来研究可关注 AbOmpA 的结构，特别是其与 CaMKK2 相互作用的区域，这将为针对鲍曼不动杆菌感染的治疗策略提供理论依据。