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这篇研究揭示了青枯菌（Ralstonia solanacearum）效应蛋白 RipD 调控植物细胞死亡的机制。RipD 通过与 BPA1-ACD11 复合体互作，竞争结合并激活自噬，剂量依赖性地调节 ACD11 蛋白稳态，影响植物免疫，为培育抗青枯病作物提供理论依据。
### 青枯菌效应蛋白 RipD 对植物细胞死亡的双重调控机制研究
在植物与病原体的长期斗争中，植物进化出了复杂的免疫系统来抵御病原体的侵害。其中，效应触发免疫（ETI）是植物免疫的重要防线，但病原体也进化出了多种策略来逃避或抑制 ETI。青枯菌（
Ralstonia solanacearum）作为一种危害严重的植物病原菌，可感染多种经济作物，导致巨大的经济损失。它分泌的效应蛋白在抑制宿主抗性中发挥着关键作用，然而其具体机制却并不完全清楚。本研究聚焦于青枯菌效应蛋白 RipD，深入探究其对植物细胞死亡的调控机制，为理解植物与病原体互作以及作物抗病育种提供了重要线索。
RipD 对植物细胞死亡的双向调控取决于其蛋白丰度
为明确 RipD 在激活或抑制细胞死亡中的功能，研究人员将来自青枯菌 GMI1000 的RipDR.s在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中瞬时表达，发现它能抑制RipAA诱导的细胞死亡，但自身不诱导细胞死亡。为进一步研究，对RipDR.s进行密码子优化，得到RipDA.t-C.O，结果其在本氏烟中引发了强烈且稳定的细胞死亡。利用 XVE 启动子驱动RipDA.t-C.O表达，并通过 GFP 标签可视化蛋白丰度，研究发现不同表达载体导致 RipD 蛋白积累量不同，且蛋白丰度决定了 RipD 诱导或抑制本氏烟细胞死亡的功能。此外，将不同的RipD表达构建体转化到拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，发现 RipD 对拟南芥的生长发育也有剂量依赖性的影响，高表达量会抑制植株生长，影响叶片形态和根的伸长。
RipD 与 BPA1 及其同源蛋白相互作用
为探究 RipD 剂量依赖性调控细胞死亡的机制，研究人员通过酵母双杂交（Y2H）文库筛选，发现 RipD 与 BPA1 相互作用，BPA1 可通过与 ACD11 相互作用调节免疫和细胞死亡。双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCA）实验进一步在体内验证了这一相互作用。拟南芥基因组编码 6 种 BPA1 的同源蛋白 BPL1 - 6，Y2H 和 BiFC 实验表明，BPL1、BPL2、BPL3、BPL4、BPL5 和 BPL6 都能与 RipD 或 ACD11 相互作用，这意味着当 BPA1 的同源蛋白与 ACD11 相互作用时，很可能也会与 RipD 相互作用。
RipD 和 ACD11 结合 BPA1 的重叠区域
为验证 RipD 和 ACD11 是否结合 BPA1 的相似区域，研究人员对 BPA1 进行了系列截短实验和相互作用分析。根据 BPA1 和 BPLs 的蛋白多序列比对以及 AlphaFold2 预测的蛋白结构对 BPA1 进行截短，得到不同片段。BiFc 分析显示，多个 BPA1 片段都能与 RipD 和 ACD11 相互作用，且 RipD 与不同片段的相互作用位置存在差异。进一步的蛋白融合实验和多种相互作用分析方法（Y2H、BiFC、LCA）表明，RipD 和 ACD11 在 BPA1 上的结合区域存在显著重叠，暗示两者可能存在竞争性结合机制。
RipD 与 ACD11 在体内竞争性结合 BPA1
通过分析 RipD 或 GFP 对 BPA1 和 ACD11 相互作用的影响，研究人员发现 RipD 能显著抑制代表 BPA1 和 ACD11 相互作用强度的荧光素酶活性，在 BiFC 实验中也显著抑制了 BPA1 - ACD11 相互作用的 YFP 信号，而对作为对照的 Ca1 和 Ca4 的相互作用无显著影响。这表明青枯菌效应蛋白 RipD 能与 ACD11 竞争性结合 BPA1 的同一区域，形成 RipD - BPA1 复合体并释放 ACD11，但 ACD11 从内源性 BPA1 - ACD11 复合体解离后的生理功能尚不清楚。
RipD 促进植物自噬激活
从能量守恒角度考虑，RipD 直接与宿主 BPA1 竞争结合 ACD11 的方式效率较低，因此研究人员推测 RipD 可能还通过其他机制作用于 BPA1 - ACD11 复合体。亚细胞定位研究发现，RipD - GFP 在本氏烟中瞬时表达时通常定位于小聚集体，部分聚集体具有类似自噬体的特征，且 RipD 与液泡标记蛋白 CBL2 共定位，暗示其参与自噬过程。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的实验表明，RipD 表达会导致对自噬激活剂雷帕霉素（Rap）的超敏反应。在本氏烟中，RipD 与自噬体标记蛋白 GFP - NbATG8f 共表达，发现 RipD 能显著促进 GFP - NbATG8f 的降解和自噬体的形成，表明 RipD 可以促进植物自噬。
RipD 调节 BPA1 和 ACD11 的蛋白质稳态
BiFC 分析发现 RipD 与 BPA1 相互作用的 YFP 信号定位于细胞内的点状聚集体，且这些聚集体会在细胞内移动，提示 RipD 可能通过促进 BPA1 进入自噬体来促进其降解。在本氏烟中瞬时表达 RipD、mCherry - BPA1 和 GFP - NbATG8f，结果显示 RipD 显著增加了细胞内自噬体的产生，且大部分自噬体与 BPA1 共定位，同时 RipD 促进了 BPA1 的降解，且随着 RipD 蛋白丰度增加，降解作用增强。然而，RipD 对 ACD11 蛋白丰度的影响与 BPA1 不同，较低丰度的 RipD 促进 ACD11 积累，较高丰度则促进其降解。使用自噬抑制剂 3 - MA 处理后，发现 3 - MA 能显著抑制但不能完全消除 RipD 干扰 BPA1 - ACD11 复合体的能力。这表明 RipD 可以激活自噬并竞争性破坏 BPA1 - ACD11 复合体，适量的 RipD 可通过自噬体促进 BPA1 降解，同时使 ACD11 积累，这一精细的剂量调节机制有待进一步研究。
青枯菌向宿主细胞输送 RipD 的可视化分析
由于 RipD 对 BPA1 - ACD11 蛋白丰度的影响具有剂量依赖性，研究人员利用荧光蛋白自组装系统 sfGFP 对青枯菌感染过程中 RipD 的分泌水平进行了量化分析。将 sfGFP1 - 10 在本氏烟叶片中瞬时表达，同时让表达 RipD - sfGFP11 融合蛋白的青枯菌侵染相应区域，通过共聚焦显微镜观察发现，随着病原菌接种密度增加，叶片中的 GFP 信号显著增强。当青枯菌接种密度达到 OD600为 0.6 时，sfGFP 荧光信号与瞬时表达的 35S - RipDR.s - GFP 相似，这表明在感染过程中，青枯菌向宿主细胞分泌的效应蛋白剂量可与 35S - RipDR.s相当。
BPA1 - ACD11 参与植物对青枯菌的抗性和细胞死亡调节
适度至低水平的 RipD 导致 BPA1 轻微降解和 ACD11 积累，促使研究人员进一步分析 BPA1 和 ACD11 对细胞死亡和青枯菌致病性的影响。通过获得拟南芥bpa1基因的功能缺失和过表达突变体，研究发现BPA1功能缺失突变体对青枯菌的抗性无显著变化，可能是由于 BPLs 与 BPA1 的功能冗余；而BPA1过表达株系对青枯菌的抗性显著增加，且感染后生长状况优于野生型植株。ACD11 是免疫和细胞死亡的负调节因子，在本氏烟中瞬时表达 ACD11 - mCherry 后再表达 RipAA，发现 ACD11 能显著延迟细胞死亡的发生，而 BPA1 和空载体对细胞死亡无显著影响。此外，研究还发现过量 RipD 诱导的细胞死亡依赖于自噬组件 ATG6 和 ATG7，而不依赖于 EDS1，这表明 RipD 诱导的细胞死亡不能仅由 ACD11 的不稳定来解释，还与其激活自噬的功能有关。
讨论
本研究发现青枯菌效应蛋白 RipD 根据其丰度抑制或诱导细胞死亡。适量的 RipD 通过竞争性结合和激活自噬，促进 ACD11 积累，抑制由无毒效应蛋白诱导的细胞死亡，有利于生物营养型病原菌的生存和增殖，揭示了一种新的抑制 ETI 样细胞死亡的机制。过量的 RipD 则可能诱导广泛的植物自噬和 BPA1 - ACD11 复合体的大量降解，导致广泛的细胞死亡，且这种细胞死亡依赖于自噬过程而非 EDS1。
RipD 对植物免疫和对青枯菌易感性的剂量依赖性调节
尽管本研究揭示了 RipD 介导的植物细胞死亡调节与剂量的关系，但 RipD 丰度对植物免疫和对青枯菌易感性的影响仍不完全清楚。已有研究表明，低丰度的 RipD 可刺激拟南芥中的 ROS 爆发、胼胝质沉积和免疫相关基因的转录，但随着 RipD 丰度增加，这些免疫激活表型逐渐受到抑制，过量的 RipD 则完全抑制这些免疫相关表型。通过诱导 pXVE - RipDA.t - C.O株系中 RipD 的表达，发现适度诱导 RipD 虽不会导致明显的细胞死亡，但会显著促进拟南芥对青枯菌的易感性。这表明青枯菌分泌的 RipD 丰度必须达到一定阈值，才能平衡细胞死亡和免疫激活，从而最大化其毒力。目前虽无法确定自然感染过程中进入宿主细胞的 RipD 量是否在实验测试范围内，但由于效应蛋白递送可视化系统的限制，自然感染时 RipD 的丰度可能被低估。
病原菌对 ETI 反应的多层抑制以克服宿主抗性
利用 NLR 蛋白识别病原菌分泌的效应蛋白是目前作物抗病育种的重要策略，但 NLR 介导的抗性常被病原菌在 3 - 5 年内克服。病原菌通常利用效应蛋白之间的相互作用来抑制 ETI 反应，促进感染和增殖。效应蛋白对 ETI 的抑制主要通过两种机制：抑制 AVR 效应蛋白的识别和抑制 ETI 信号级联反应。本研究中的 RipD 通过一种新的机制广泛抑制 ETI 反应，能够抑制至少两种 Avr 效应蛋白（RipAA 和 RipE1）诱导的细胞死亡，其具有抑制和诱导死亡的双重特性，与之前报道的 AvrPtoB 类似。RipD 诱导的细胞死亡不依赖于经典的 ETI 信号级联反应，而是依赖于自噬，这表明植物可能通过不同的途径保护 BPA1 - ACD11 复合体，或者这只是一种细胞毒性形式。
ACD11—— 细胞死亡的重要调节因子，受到复杂精确的调控
ACD11 是一种神经酰胺 - 1 - 磷酸（C1P）转移蛋白，其功能缺失会导致细胞死亡，这是由于多种脂质信号分子的代谢紊乱以及 ETI 免疫过程的激活。ACD11 的蛋白稳态和亚细胞定位受到多种因素的复杂调控，如 RING 型 E3 连接酶 XBAT35.2 可促进其降解，BPA1 及其同源蛋白则有助于维持其稳定性。此外，ACD11 还与多种功能不同的蛋白相互作用，这些蛋白如何相互调节以最终影响 ACD11 的功能，是一个复杂且重要的研究方向，有待进一步深入探索。
研究的局限性
适量的 RipD 导致 BPA1 轻微降解和 ACD11 积累，其具体机制尚不清楚，可能是 RipD 与 BPA1 结合干扰了 ACD11 与其他调节蛋白的结合，但详细机制仍有待研究。过量的 RipD 导致自噬依赖性细胞死亡，然而自然感染过程中青枯菌分泌到宿主细胞的 RipD 水平是否能达到这一阈值尚不清楚。在可视化 RipD 递送的实验中，使用的是非宿主本氏烟和青枯菌菌株 GMI1000 的相互作用系统，广泛的细胞死亡限制了对 RipD 递送的长期检测。
本研究通过对青枯菌效应蛋白 RipD 的深入研究，揭示了其调控植物细胞死亡的新机制，为理解植物与病原菌的相互作用提供了重要依据，也为作物抗病育种提供了新的思路和潜在的靶点。未来的研究可进一步深入探究 RipD 作用机制的细节，以及如何利用这些发现培育更具抗性的作物品种，以应对青枯菌等病原菌对农业生产的威胁。
