编辑推荐：
本研究聚焦H5N1禽流感病毒进化趋势，揭示其NA蛋白长茎突变对跨物种传播的潜在影响（HPAI H5N1, NA）
自2020年以来，H5N1高致病性禽流感病毒（HPAI H5N1）2.3.4.4b分支在全球野生鸟类中迅速传播，并导致大量哺乳动物感染以及超过70例已知人类病例。该病毒还于2023年底/2024年初跨越物种屏障，在美国的奶牛中引发疫情。H5N1病毒的神经氨酸酶（NA）蛋白N1亚型的茎区可能存在截短，这在禽类中被认为是潜在的致病性因素，但对哺乳动物的传播可能产生负面影响。自1996年A/鹅/广东/1/1996谱系出现以来，大多数HPAI H5N1分离株都具有这种截短的NA茎区。然而，随着2020年2.3.4.4b分支的扩张，这一情况发生了变化，目前大多数分离株，包括在奶牛中流行的菌株，都具有长NA茎区。
该研究的重要性在于，尽管N1神经氨酸酶茎区的截短版本可能与禽类中增加的致病性相关，但长版本的茎区与哺乳动物中增加的传播性相关。目前在全球范围内广泛流行的2.3.4.4b分支H5N1病毒中，绝大多数具有长茎区的神经氨酸酶，这可能增加了这些病毒在人与人之间传播的风险。
2020年，H5N1 A/鹅/广东/1/1996高致病性禽流感病毒2.3.4.4b分支开始在欧亚大陆迅速扩张。2021年底/2022年初，该病毒通过冰岛的候鸟从欧洲跨越大西洋，并从亚洲进行了额外的引入。此后，该病毒在美洲迅速传播，甚至到达南极洲。目前，2.3.4.4b分支H5N1在野生鸟类中已广泛建立（除澳大利亚外），导致家禽中出现广泛问题，食腐哺乳动物中出现广泛（死端）感染，水貂养殖场和海洋哺乳动物中疑似出现持续的哺乳动物-哺乳动物传播，并在美国奶牛中引发持续爆发。此外，已报告至少70例人类病例，其中6例为重症病例，导致2例死亡（美国1例，中国1例），尽管大多数病例被描述为轻度。
自2010年代在亚洲出现以来，2.3.4.4分支H5病毒已与多种禽流感病毒广泛重配，并以H5NX病毒的形式传播，其中X主要是N2、N5、N6、N8或N9神经氨酸酶（NAs）。然而，导致当前大流行爆发的2.3.4.4b亚分支却再次成为H5N1病毒。除了血凝素（HA）的多碱基切割位点被认为是HPAI的主要致病性因素外，NA被认为也可能对致病性有所贡献。NA活性对于从感染细胞中释放出芽病毒颗粒以及穿透黏膜液体至关重要。NA（受体破坏酶）的活性与HA（受体结合蛋白）的活性之间存在平衡，这种平衡决定了在不同物种中的适应性。NA的长茎区（野生型）可能会被截短，这可能会影响NA活性。NA茎区的截短已在N1、N2、N3、N5、N6和N7亚型中发现，且大多与家禽宿主相关。然而，尚不清楚为什么截短与这些特定亚型相关，而与其他亚型无关。由于茎区通常存在糖基化位点，因此茎区的截短可能会改变NA的整体糖基化状态，这可能调节病毒稳定性，糖基化较少被认为与较低的稳定性相关。在H5N1病毒中，NA茎区的截短与小鼠、鸡和绿头鸭中的致病性增加相关，并可能增加鸡中的传播性。然而，并非在所有实验设置中都观察到鸡的致病性增加。在H7N1病毒中，N1茎区长度的减少也会导致鸡的致病性增加，但会降低北京鸭中的复制和脱落。在大流行H1N1和H7N9病毒中，NA茎区较短的病毒在小鼠中致病性增加。然而，H5N1病毒（在大流行H1病毒背景下）的N1 NA截短版本并不支持雪貂中的飞沫传播，显示出穿透人类黏液的能力降低，并导致病毒聚集。增加茎区长度可增加雪貂中的直接接触和飞沫传播，表明具有长茎区的H5N1病毒可能比短茎区版本具有更高的哺乳动物-哺乳动物传播潜力。
为了比较A/鹅/广东/1/1996谱系H5N1病毒N1神经氨酸酶的序列进化，研究人员从NCBI病毒服务器下载了每年一份的示例序列，并进行了比对。这些序列来自多种物种，包括鸡、鸭、火鸡或贝加尔 teal。尽管最初的A/鹅/广东/1/1996谱系具有长NA茎区，但在20世纪90年代末，N1茎区出现了20个氨基酸长度的截短（以下简称“短茎”）。从2002年起，长茎区几乎消失，直到2022年重新出现。值得注意的是，长茎区还增加了四个潜在的N-糖基化位点（NQS、NNT、NQT和NIS）。
为了更准确地研究长茎区NA的出现和重新出现，研究人员分析了全球流感数据共享倡议（GISAID）EpiFlu服务器上每年可用的所有H5N1序列。具有长茎区N1的H5N1序列在1999年至2001年期间的测序H5N1样本中占多数，但此后，长茎区的比例逐渐下降。然而，表达长N1茎区的病毒一直在低水平循环，每年都能识别出具有长茎区序列的H5N1 HPAI病毒样本，这与之前的发现一致。从2021年起，长茎区N1再次成为H5N1样本中的主导。
目前流行的2.3.4.4b分支H5N1病毒中，绝大多数表达长茎区NA：100%的哺乳动物样本和99%的禽类样本，包括鸡、哑天鹅、狐狸、猫和奶牛等。有趣的是，2024年从野生鸟类和家禽物种中分离的H5N1病毒中，约65%和80%的长茎区序列与1996年的序列（“CNQSIITYENNTWVNQT”）相同，而哺乳动物物种的比例更高（88.2%-100%）。这可能暗示野生鸟类中长茎区的进化速度更快。在手动分析了2.3.4.4b分支H5N1中的所有“短”序列（13,335个总序列中，有150个被识别为短序列）后，研究人员发现它们包含新的缺失，这些缺失与2000年至2020年期间观察到的缺失不匹配。这些新的缺失主要出现在西非地区，2021年至2024年期间在欧洲和北美也有少数孤立的例子，但它们似乎并未广泛传播。总体而言，这些发现表明2.3.4.4b分支H5N1病毒表达长茎区N1，且茎区组成和长度的进化仍在进行中。
另一个观察结果是，当研究N1神经氨酸酶的头部结构域时，从1998年至2019年在N1头部结构域中发生的一些突变似乎在2020-2021年期间恢复到1997年或1998年至2001年期间观察到的状态。然而，如果仅在包含长茎区N1的样本中分析这些位点的进化，可以发现其中大多数在多年间并未发生进化。这表明具有长茎区NA的H5N1病毒自1996年以来至少以非主导变异的形式存在——要么持续存在，要么通过与禽类HXN1病毒的重配。这一结论得到了使用1996年至2024年所有年份的H5N1 NA头部结构域序列（但删除了茎区部分）创建的系统发育树的支持。即使仅考虑头部结构域，也会形成两个不同的群体，分别包含长茎区和短茎区。只有一个分支包含长茎区和短茎区序列，该分支也包括祖先A/鹅/广东/1/1996序列。该
